Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Beschreibung eines quantitativen Phosphorylierung Verfahren mit cryolysis, Harnstoff solubilziation, HILIC Fraktionierung und IMAC Anreicherung von phosphorylierten Peptiden.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt das Wachstum und die Anregung, mit der Fettsäure Oleat, der isotopisch schweren und leichten S. cerevisiae-Zellen. Die Zellen werden unter Verwendung einer cryolysis Verfahren in einer Kugelmühle Mühle und die daraus resultierenden grindate in Lösung von Harnstoff Solubilisierung gebracht. Dieses Verfahren ermöglicht die Lyse der Zellen in eine metabolisch inaktiven Zustand, Erhaltung Phosphorylierung und verhindert Neuausrichtung der Phosphoproteom während der Zelllyse. Nach der Reduktion, Alkylierung, Trypsinverdauung der Proteine werden die Proben auf C18-Säulen und die Probe Komplexität durch Fraktionierung unter Verwendung von hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) reduziert entsalzt. HILIC Säulen bevorzugt behalten hydrophile Moleküle, die gut für phosphoproteomics geeignet ist. Phosphorylierte Peptide neigen dazu, später eluieren in der chromatographische Profil als die nicht phosphorylierte Pendants. Nach der Fraktionierung sind Phosphopeptide angereichert mit immobilisierten Metall-Chromatographie, die gegen Gebühr-basierte Affinitäten für Phosphopeptid Bereicherung beruht. Am Ende dieses Verfahrens werden die Proben bereit, quantitativ durch Massenspektrometrie analysiert werden.
Protocol
Discussion
Diese Methode wird zu einer Bereicherung der Phosphopeptide quantitativ analysiert werden kann. Eine Reihe von Parametern können in diesem Protokoll verändert werden, aber der wichtigste Aspekt zu erinnern ist, Ihre Phosphorylierung zu bewahren. Vorbereitung der Zellen für die Quantifizierung kann in einer Reihe von verschiedenen Wegen erreicht werden, zum Beispiel, wenn Sie nicht Etikett Ihre Zellen in vivo, tags wie ICAT [3] oder iTRAC [4] kann nach der Extraktion verwendet werden, um differentiell Label z…
Acknowledgements
Wir möchten Dr. Rich Rogers für die technische Unterstützung danken, mit der Massenspektrometrie analysiert und hilfreiche Diskussionen und Drs. Rob Moritz, Jeff Ranish und Hamid Mirzai für hilfreiche Diskussionen.
Diese Arbeit wurde durch die NIH Centers of Excellence finanziert.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
References
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