Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.
Abstract
Een stamcel is gedefinieerd als een cel met de capaciteit om zowel de zelf-vernieuwing en het genereren van meerdere gedifferentieerde nageslacht. Embryonale stamcellen (ESC) zijn afgeleid van de blastocyst van de vroege embryo en zijn pluripotent in differentiative vermogen. Hun ruime differentiative potentieel heeft hen de focus van veel onderzoek gericht op het afleiden hoe ze te coax te klinisch bruikbare soorten cellen te genereren. De succesvolle afleiding van hematopoietische stamcellen (HSC) van muis ESC is onlangs bereikt en kunnen worden gevisualiseerd in deze video protocol. HSC, misschien wel de klinisch meest uitgebuite cel populatie, worden gebruikt om een groot aantal hematopoietische maligniteiten en aandoeningen te behandelen. Echter, veel patiënten die baat kan hebben bij HSC therapie geen toegang tot geschikte donoren. ESC zou kunnen bieden een alternatieve bron van HSC voor deze patiënten. Het volgende protocol voorziet in een basislijn vanwaar ESC-HSC kan worden bestudeerd en op de hoogte inspanningen om HSC isoleren van menselijke ESC. In dit protocol worden ESC gedifferentieerd embryoid instanties (EBS) voor 6 dagen in de handel verkrijgbare serum vooraf gescreend voor een optimale hematopoietische differentiatie. EBS worden vervolgens gescheiden en geïnfecteerd met retrovirale HoxB4. Geïnfecteerde EB-afgeleide cellen worden uitgeplaat op OP9 stroma, een beenmerg stromale cellijn afgeleid van de Calvaria van M-CSF-/ – muizen, en co-gekweekt in de aanwezigheid van hematopoiese het bevorderen van cytokines voor tien dagen. Tijdens deze co-cultuur, de geïnfecteerde cellen sterk uit te breiden, wat resulteert in de generatie van een heterogene pool van 100s van miljoenen cellen. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt om de reddings-en reconstitueren dodelijk bestraalde muizen.
Protocol
Differentiatie van embryonale stamcellen Verzamel een bijna samenvloeiing fles van embryonale stamcellen (ESC) via een behandeling met trypsine ESC. Resuspendeer cellen in 5 ml Differentiatie media en over te dragen aan een niet-gelatine gecoate T25. Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten. Ophalen supernatant en het verzamelen van cellen via centrifugeren. Let op: muis embryonale fibroblasten (MEF) van het ESC culturen hechten gemakkelijk aan de niet-gelatine gecoate T25 en dus zi…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice
Animal
Taconic Farm
Plate shaker
Tool
VWR
33998-360
Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor
Tool
VWR
15000-174
ePet by BioHit
ES trypsin
Reagent
Invitrogen
15090-046
0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin
Reagent
Invtrogen
25300-062
0.05% Trypsin-EDTA
PBS
Buffer
Invitrogen
20012-027
Enzyme-free dissociation buffer
Buffer
Invitrogen
13151-014
Dissociation enzyme mix
Buffer
Invitrogen
17104-019
500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase
Reagent
Sigma
H2126
freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.