שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם
Summary
בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד ללמוד<em> In vivo</em>. כאן, אנו מציגים רומן<em> במבחנה</em> גישה לחקור אינטראקציות חלבון-RNA באמצעות מאגר סינתטי אוליגו כי אריחים על פני אזורים נבחרים של mRNA מראש.
Abstract
סידור RNAs כי שיתוף immunoprecipitate (Co-IP) עם חלבונים RNA מחייב גדלה ההבנה שלנו של שחבור ידי הוכחת כי המיקום מחייב לעתים קרובות משפיעה על תפקוד של גורם שחבור. עם זאת, כמו כל אסטרטגיה הדגימה את הסיכוי לזיהוי RNA חייב גורם שחבור הוא יחסי שפע הסלולר שלה. פיתחנו רומן בגישה חוץ גופית עבור מדידות סגוליות מחייבים חולף אחרת מראש mRNA. גישה זו משתמשת בריכה oligonucleotide שתוכננו במיוחד כך פני אריחי אינטרונים, אקסונים, צמתים אחוי, או אחר מראש mRNA. הבריכה היא נתון כלשהו מבחר מולקולרית. הנה, אנחנו מדגימים את השיטה על ידי הפרדת oligonucleotide לתוך חלק כבול מאוגד ולנצל שני מערך צבע אסטרטגיה כדי להקליט את העשרת oligonucleotide כל שבריר כבול. הנתונים מערך מייצר ברזולוציה גבוהה מפות עם היכולת לזהות רצף ספציפי מבניים determinates של ribonucleoprotein (RNP) מחייב mRNA מראש. יתרון ייחודי שיטה זו היא היכולת שלה למנוע הטיה כלפי הדגימה mRNA הקשורים ה-IP הנוכחית וטכניקות Selex, כמו הבריכה היא תוכננה במיוחד ו מסונתז מתוך רצף ה-mRNA מראש. הגמישות של הבריכה oligonucleotide הוא יתרון נוסף מאז הנסיין בוחר אילו אזורים ללמוד על פני אריח, בהתאמת הבריכה הצרכים האישיים שלהם. באמצעות טכניקה זו, ניתן assay את ההשפעות של פולימורפיזם או מוטציות על הכריכה בקנה מידה גדול או לשכפל את הספרייה לתוך כתב שחבור פונקציונלי לזהות oligonucleotides כי מועשרים בשבריר כלל. זה רומן במבחנה ברזולוציה גבוהה תוכנית מיפוי מספק דרך ייחודית ללמוד אינטראקציות עם RNP מראש mRNA מינים חולפים, אשר נמוך שפע גורם להם קשה ללמוד עם הנוכחי טכניקות vivo.
Protocol
Discussion
כשעושים הליך זה חשוב שלה לזכור כי הקמת הבריכה היא גמישה ופתוחה לשינויים בבית או RNA או רמת חלבון. ברמה RNA האזורים orthologous, מוטציות מחלה, פולימורפיזמים, או מוטציות אקראיות יכול להיות מוחדר רצף oligonucleotide. ברמת החלבון גורם RNA מחייב ניתן לשנות על ידי זרחון או שינויים אחרים לפרס…
