نهج عملي لرسم الخرائط الوراثية محرض مصير : دليل مرئي لمارك وتعقب خلايا في فيفو</em
Summary
رسم الخرائط الجينية مصير محرض (GIFM) علامات المسارات والخلايا مع غرامة السيطرة المكانية والزمانية<em> في الجسم الحي</em> ويوضح كيفية الخلايا من سلالة وراثية محددة تسهم في تطوير وأنسجة البالغين. أظهرت هنا هي التقنيات المطلوبة لتعيين مصير أجنة الفئران E12.5 للتحليل وepifluorescent ازدراع.
Abstract
يتم إنشاؤها بواسطة خرائط مصير وسم وتعقب الخلايا في الجسم الحي لتحديد كيفية المساهمة في الأسلاف هياكل محددة وأنواع الخلايا والأنسجة في تطوير الكبار. تقدم في هذا المفهوم هو G enetic أنا أكلت nducible F M apping (GIFM) الذي يربط بين التعبير الجيني ، مصير الخلية ، والسلوكيات خلية في الجسم الحي ، لإنشاء الخرائط على أساس النسب مصير الجينية.
GIFM يستغل X – CreER خطوط حيث X هو جين أو مجموعة من العناصر التنظيمية التي تمنح الجينات التعبير المكاني للبروتين البكتيريا المحورة ، لجنة المساواة العرقية recombinase (CreER T). CreER T يحتوي على تعديل ه strogen يجند eceptor ص المجال الملزمة التي تجعل CreER T المحتبسة في السيتوبلازم في غياب تاموكسيفين المخدرات. الربط من CreER تاموكسيفين T النشرات التي translocates إلى النواة وإعادة التركيب يتوسط بين تسلسل الحمض النووي محاط مواقع loxP. في GIFM ، تأشب يحدث عادة بين loxP يحيط إيقاف الكاسيت السابقة جين مراسل مثل GFP.
هي ولدت الفئران لاحتواء أي منطقة أو خلية نوع محدد CreER وأليل مراسل الشرطي. سوف الفئران غير المعالجة لا نملك بمناسبة لأن الكاسيت في إيقاف مراسل يمنع النسخ مزيد من الجين المراسل. ندير تاموكسيفين بالتزقيم عن طريق الفم لتوقيت الحامل الإناث ، التي تنص على مراقبة الزمنية للإفراج T CreER وإزفاء اللاحقة إلى نواة إزالة كاسيت من إيقاف الصحفي. بعد إعادة التركيب ، وأليل المراسل هو constitutively وأعرب عن heritably. هذه السلسلة من الأحداث علامات مثل هذه الخلايا التي يتم تسجيلها لا يمحى تاريخهم الجينية. مراسل معاد يخدم بالتالي بمثابة التتبع الإخلاص النسب العالية التي الجينية ، مرة واحدة ، يتم uncoupled من التعبير الجيني يستخدم في البداية لحملة CreER تي.
نحن نطبق GIFM في الماوس لدراسة التطور الطبيعي والتأكد من مساهمة الأنساب الجينية لأنواع الخلايا والأنسجة الكبار. ونحن أيضا استخدام GIFM لمتابعة الخلايا على الخلفيات الوراثية الطافرة من أجل فهم أفضل الظواهر المعقدة التي تحاكي السمات البارزة من الاضطرابات الجينية البشرية.
هذه المقالة الفيديو دلائل الباحثين من خلال الطرق التجريبية لتطبيق بنجاح GIFM. نحن لشرح طريقة استخدام لدينا تتميز كذلك Wnt1 – T CreER ؛ الفئران التي mGFP بالإدارة تاموكسيفين في اليوم الجنينية (E) 8.5 خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم تليها في تشريح وتحليل من قبل E12.5 stereomicroscopy epifluorescence. نظهر أيضا كيفية الدقيقة تشريح مصير المجالات المعينة لإعداد يزدرع أو تحليل وتشريح FACS الكبار مصير المعنونة لتصوير أدمغة جبل بأكمله الفلورسنت. مجتمعة ، هذه الإجراءات تسمح للباحثين لمعالجة المسائل الحرجة في البيولوجيا التطورية ونماذج المرض.
Protocol
Discussion
ويمكن استخدام هذا النظام الذي GIFM أننا أظهرنا للرد على مجموعة واسعة من الأسئلة في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الفئران المهندسة مع السائقين لجنة المساواة العرقية المختلفة لاستهداف أي نوع من الخلايا والأنسجة الوراثية أو نسب الفائ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لأربر S. للفئران mGFP وأعضاء المختبر Zervas الذي قرأ ورقة نقدية ، وقدمت المساعدة التقنية. كان مدعوما من قبل ألف براون الدماغ الصيف كابلان علوم جائزة بحوث الدراسات العليا. وأيد نورمان E. بواسطة برنامج جائزة العلوم أبحاث الدماغ العليا. وقد تم تمويل هذا البحث أيضا من أموال الأبحاث بدء التشغيل (MZ).
References
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
