Протокол Производство KLRG1 тетрамер
Summary
Этот протокол описывает производство KLRG1 тетрамер, который является мощным инструментом для анализа KLRG1 лигандами.
Abstract
Убийца ячейки лектин-подобный рецептор G1 (KLRG1) является трансмембранный гликопротеин II типа тормозных рецепторов принадлежащих тип С лектин-подобный надсемейства. KLRG1 существует как мономер и как дисульфид-связанных гомодимера. Это хорошо сохраняется рецептор находится на самых зрелых и недавно активированных NK клеток, а также на подмножестве эффектор / память Т-клеток.
Использование KLRG1 тетрамер, а также другие методы, E-, N-, и R-кадгерины были определены как KLRG1 лигандами. Эти Са 2 +-зависимые межклеточных молекул адгезии состоит из внеклеточного домена, содержащий пять кадгерина повторяет ответственность за межклеточных взаимодействий, трансмембранный домен и цитоплазматический домен, который связан с актином цитоскелета.
Генерация KLRG1 тетрамер имеет важное значение для идентификации KLRG1 лигандами. KLRG1 тетрамер также уникальный инструмент для выяснения роли кадгерина и KLRG1 играть в регуляции иммунного ответа и целостности тканей.
Protocol
Discussion
В этом протоколе, показано, как очистить, biotinylate и tetramerize KLRG1. KLRG1 тетрамер могут быть использованы для обозначения KLRG1 лигандов с помощью проточной цитометрии. Хотя рефолдинг условия должны быть проверены эмпирически для каждого белка, других C-типа лектинов может быть tetramerized использова?…
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Найденко за помощь в оптимизации рефолдинг условиях. Эта работа была поддержана исследовательский грант NIH AI58181 Лорана Brossay. Синди Banh поддерживается NIH НРСА F31 AI080230.
Стефани Terrizzi и Синди Banh в равной мере участвовать в этой работе.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , .
