전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가
Summary
주문한 막 단백질 배열의 형성을위한 2 차원 (2D) 결정화 실험을 평가하는 것은 전자 crystallography에 매우 중요하고 어려운 작업입니다. 90kDa – 여기에 대한 심사와 15의 범위에서 주로 작은 막 단백질의 2D 결정을 식별하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.
Abstract
전자 crystallography 중 하나 또는 또는 구조 기능 막 단백질의 질문에,뿐만 아니라 수용성 단백질을 연구 세 가지 차원 결정화 및 X – 선 crystallography와 함께 사용할 수있는 방법으로 진화했다. 전송 전자 현미경에 의해 2 차원 (2D) 결정에 대한 심사는 (EM) 최적화, 그리고 cryo – EM하여 고해상도 데이터 수집에 대한 샘플을 선택 찾는 중요한 단계입니다. 여기 우리는 잠재적으로 결정화 조건의 최적화에 대한 중요한 정보를 제공 수, 대형 및 주문뿐만 아니라, 작은 2D 배열을 모두 식별에 근본적인 단계를 설명합니다.
EM에서 서로 다른 배율과 협력함으로써, 중요한 매개 변수의 범위에있는 데이터가 얻어진다. 낮은 배율은 형태학 및 멤브레인 크기에 귀중한 자료를 제공합니다. 높은 배율에서 가능한 순서 및 2D 크리스탈 크기가 결정됩니다. 이러한 맥락에서, 그것은 CCD 카메라와 온라인 푸리에 변환이 순서와 크기 proteoliposomes을 평가하기 위해 더 높은 배율에서 사용하는 방법에 설명되어 있습니다.
막 단백질의 2D 결정이 가장 일반적으로 투석에 의해 reconstitution에 의해 성장하는 동안, 심사 기술 monolayers, 기본 차원 결정의 도움으로 제작 결정에 동일하게 적용되며, 수용성 단백질의 배열을 명령했다. 또한, 여기에서 설명한 방법 작은 단백질이 큰 단백질 우리의 예제와 격자로 식별에있는 치료의 동일한 금액을 요구에도 소규모의 2D 결정뿐만 아니라 큰 멤브레인 단백질에 대한 심사에 적용되는 더 쉽게 식별할 수있을 심사의 이전 단계에서.
Protocol
Discussion
샘플 적절한 평가는 세포막의 충분한 숫자의 신중 평가가 필요합니다. 예를 들어, 180여 군데 proteoliposomes 밖으로 낮은 % 2로 결정 배열 샘플 2D 결정화 조건 7 빠르고 최적화에 대한 중요한 정보를했다.
단백질의 일부 가끔 침전이 발생하지만, 단백질의 침전이 발생하면, 그리드는 낮은 배율에서 검사 후 추가 검사에서 버려진 수 있습니다. 100 개 미만 NM의 비록 아?…
Acknowledgements
우리는 우리의 방법과 관련된 경험과 관찰의 일부에 기여 귀중한 단백질 샘플을 제공하는 우리의 공동 작업자를 주셔서 감사합니다. 군터 Schmalzing은 친절이 프로젝트에 참여 FR 수있는 기회를 제공했습니다. 바바라 암브러스터, 야곱 브링크 및 Deryck 밀스가 자신의 뛰어난 도움말 및 장비에 대한 입력을위한 감사합니다. 기금은 NIH 부여 HL090630에 의해 제공되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
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