Larval Ring Drüsensektion: Isolierung der entwicklungsfreien endokrinen Organe von Drosophila

Published: April 30, 2023

Abstract

Quelle: Imura, E., et al. Protokolle zur Visualisierung steroidogener Organe und ihrer interaktiven Organe mit Immunostainierung in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. J. Vis. (2017).

Dieses Video beschreibt die Drosophila-Ringdrüse, eine komplexe endokrine Struktur, die für die Biosynthese und Sekretion von Ekdysteroiden und anderen Hormonen wichtig ist. Das vorgestellte Protokoll demonstriert seine Zerlegung, Fixierung und Immunfärbung.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Imura et al.,Protokolle zur Visualisierung steroidogener Organe und ihrer interaktiven Organe mit Immunostainierung in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017). HINWEIS: Das Gesamtschema der Protokolle ist in Abbildung 1dargestellt. 1. Die Zerlegung der Larval Ringdrüse (RG) HINWEIS:</s…

Representative Results

Abbildung 1: Das Gesamtschema der Protokolle. Je nach Zweck der Experimente sind zwei unterschiedliche Seziermethoden auf Larven und erwachsene Weibchen anwendbar. Die Montagemethoden werden auch nach Probenbedingungen entwickelt. Befestigungs-, Färbe- und Bildgebungstechniken sind grundsätzlich in allen Proben üblich. Bitte klicke…

Materials

Egg collection
tissue culture dish (55 mm) AS ONE 1-8549-02 for grape-juice agar plates
collection cup HIKARI KAGAKU
yeast paste Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) SARSTEDT 58.487
disposable loop AS ONE 6-488-01
standard fly food The recipe is on the website of Bloomington stock center.
Dissection
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
dissecting microscope Leica S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) IWAKI 1000-035
Sylgard TORAY coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) TERUMO NN-2719S A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5 Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter) Shiga Brand for fillet dissection
micro scissors NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. MB-50-10
Fixation
ultrapure water Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde Nacalai tesque 16222-65
Paraformaldehyde Nacalai tesque 02890-45
Triton-X100 Nacalai tesque 35501-15
microtubes (1.5 ml) INA OPTIKA CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker) As one TM-300 rocker
Bovine Serum Albumin SIGMA 9048-46-8
Primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000 Molecular Probes A6455 Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 Nakarai tesque 04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500 SIGMA S5545
anti-Hts 1B1 (mouse) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 DSHB DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50 DSHB nc82
Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin Life Technologies A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. SS7213
Square microscope cover glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent) Calbiochem 345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) WATSON 5660-222-1S
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4 from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4 from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

Play Video

Cite This Article
Larval Ring Gland Dissection: Isolation of Developmental Endocrine Organs from Drosophila. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20145, doi: (2023).

View Video