Il protocollo descrive l’abbattimento mirato dell’espressione genica nel pesce zebra mediante iniezione di morfolino nella coda.
Protocol
1. Iniezione di morfolino Il giorno prima di iniettare il morfolino, fare una piastra di iniezione (Figura 1). Assicurati di tagliare una tacca ad un’estremità del pozzo, il che aiuta a stabilizzare il pesce per la procedura di microiniezione. Diluire il morfolino taggato con fluoresceina alla giusta concentrazione (si consiglia di iniziare con 1,2 mM) e mettere in un bagno d’acqua a 65 °C, per 5 minuti. Caricare l’ago con il morfolino(nota:</stron…
Representative Results
Figura 1. A. Schema della piastra di iniezione, che è fatta di agarosio e contiene un piccolo pozzo per contenere il pesce durante la microiniezione del morfolino. Figura 2. Schema della microiniezione di morfolino. A. La commissione per l’a Metti il pesce nel piatto con la t…
Materials
Morpholino
GeneTools, LLC
Morpholino should be custom designed to your protein of interest
Micro-injection pump
World Precision Instruments, Inc.
PV830
Pneumatic PicoPump Many different microinjection systems could be used
Micro-manipulator
World Precision Instruments, Inc.
MMJR
Right-handed (MMJL for lefthanded)
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter
World Precision Instruments, Inc.
1B100F-4
These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle
Needle holder
World Precision Instruments, Inc.
5430-ALL
Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket
Needle puller
Sutter Instrument Co.
P-97
Other micropipette/needle pullers should also work
Microscope
Leica, Nikon, Zeiss
Number varies depending on the manufacturer
Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators
2-Phenoxyethanol
Sigma-Aldrich
77861-1L
Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia
Morpholino Injection: A Method to Knockdown Target Gene Expression to Study Function in Zebrafish. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20182, doi: (2023).