Montaggio agar stratificato: preparazione di embrioni zebrafish vivi per l'imaging a lungo termine con un microscopio invertito

Abstract

Fonte: Upadhyay S., et.al. Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale a time-lapse estesa di embrioni interi di zebrafish. J. Vis. Exp. (2020).

Questo articolo descrive un metodo per montare embrioni di zebrafish vivi per l’imaging a lungo termine. Questo metodo è conveniente e facile da eseguire utilizzando normali stoviglie di microscopia con fondo di vetro per l’imaging su microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarosio a diverse concentrazioni.

Protocol

1. Preparazione degli embrioni Dopo l’accoppiamento, raccogliere embrioni in E3 in una piastra di Petri e incubarli a 26,5 °C per circa 28 ore prima del montaggio.NOTA: Ciò rallenta lo sviluppo degli embrioni in modo che gli embrioni siano approssimativamente a 30 gradi all’inizio dell’imaging. Anestetizzare gli embrioni in 0,016-0,020% tricaina in E3. Per inibire la pigmentazione, aggiungere PTU a una concentrazione di 200 μM. Dechorionare gli embri…

Representative Results

Figura 1 : Descrizione del metodo di montaggio. (A) Aggiungere l’embrione zebrafish al piccolo pozzo creato dal fondo di vetro nel piatto da 35 mm. (B) Aggiungere lo strato di agarosio 1 al piccolo pozzo per coprire l’embrione. (C) Posizionare con cura un vetro di copertura sul piccolo pozzo. (D) Aggiungere lo strato di agarosio 2 su tutto il fondo del piatto da 35 mm. (E) Aggiungere E3 al piatto. (F) Disegno schematico d…

Materials

Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22×22 mm	VWR	48366 067