Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

Summary

Este artigo descreve um protocolo para isolamento e manutenção de culturas de fibroblastos primários da pele e do tecido pulmonar dos roedores silvestres.

Abstract

A importância de usar pilhas, ao invés de linhas celulares de cancro, para estudos biológicos está se tornando amplamente reconhecida. Pilhas são preferidas em estudos de células a apoptose ciclo de controle, e reparo do DNA, como as células cancerosas carregam mutações em genes envolvidos nestes processos. Pilhas não podem ser cultivadas indefinidamente devido ao início da senescência replicativa ou aneuploidization. Assim, novas culturas devem ser estabelecidas regularmente. O procedimento para o isolamento de fibroblastos de roedores embrionárias está bem estabelecida, mas isolar culturas de fibroblastos adultos, muitas vezes representa um desafio. Fibroblastos de roedores adultos isolados a partir de modelos do rato da doença humana pode ser um controle preferidos quando comparando-os com fibroblastos de pacientes humanos. Além disso, os fibroblastos adultos são o único material disponível quando se trabalha com roedores silvestres onde as fêmeas grávidas não podem ser facilmente obtidos. Aqui nós fornecemos um protocolo para isolamento e cultura de fibroblastos da pele de roedores adultos e os pulmões. Nós usamos este procedimento com sucesso para isolar os fibroblastos de mais de vinte espécies de roedores a partir de ratos de laboratório e em ratos de roedores silvestres como o castor, porco-espinho, e esquilo.

Protocol

1. Antes de Começar Esterilizar a tesoura e uma pinça com etanol 70%. Lugar agitador magnético pequeno dentro de um copo 30 mL, cobrir com duas camadas de papel alumínio, e autoclave. Prepare a 28 unidades Wunsch / mL solução estoque de Liberase Blendzyme 3 em água estéril. Faça alíquotas 0,5 mL e congelar a -20 ° C. Descongelar uma alíquota de novo antes de cada utilização. A solução pode parecer turvo após o descongelamento. Vortex a solução até que fique claro. …

Discussion

Fibroblastos normais primárias oferecem uma excelente alternativa para as linhas de células de câncer estabelecido na pesquisa biológica. Uma vantagem importante de fibroblastos é que eles não carregam mutações em oncogenes e supressores de tumor e manter postos de controle do ciclo celular intacto. Isso faz com que fibroblastos normais de um sistema preferido para os estudos de regulação do ciclo celular, reparo do DNA e apoptose. O protocolo aqui descrito fornece uma receita simples para o isolamento e manut…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM/F12 media		Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified		Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic		Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin		Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade		Roche	05401127001	Replacement enzyme.
				A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 – 10 mg, Cat. no. 05401127001 – 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media		ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel		Multiple suppliers
Three Gas Control incubator		Forma or Heraeus