离体心脏灌流的Langendorff -模式,配合<sup> 31</sup> P核磁共振光谱,结合成一个实验生物化学和生理学等领域。该协议允许动态测量高能磷酸含量和心的同时监测生理功能的营业额。当正确执行,这是一个有价值的技术评估心脏能量。
生物工程小鼠模型已成为强大的研究工具,在确定分子改变和心血管疾病的模型之间的因果关系。虽然分子生物学识别信号转导通路中的关键变化是必要的,它是不是功能意义的替代品。虽然生理功能的问题提供答案,在完整的生理生化代谢物评估相结合,跳动的心脏,使心脏功能和能量的一个完整的画面。多年来,我们的实验室已利用离体心脏灌注核磁共振(NMR)谱相结合来完成这项任务。左室功能评估的Langendorff模式离体心脏灌注,而心脏的能量是通过执行计量<sup> 31</sup>灌注心中的P磁共振波谱。有了这些技术,在心脏功能相结合,与磷酸肌酸和ATP水平的指标可以同时测量跳动的心。此外,这些参数可以被监控,生理或病理应激而。例如,可以采用缺血/再灌注或高工作量的挑战协议。绑扎主动脉瓣或其他心肌病理模型的使用以及APT。无论在协议的变种,分子的转基因小鼠模型的修改功能和充满活力的意义,可以充分说明,领导到相关的酶和代谢途径的新见解。因此,<sup> 31</sup> P核磁共振光谱在离体心脏是一个有价值的研究方法,在心血管疾病的动物模型。
31个P核磁共振光谱的Langendorff灌注的离体小鼠心脏提供可靠和可重复性的数据。3,4然而,当务之急是完成主动脉插管和LV的球囊插入正确等,让心脏功能稳定,而里面的核磁共振管。此外,温度调节,以达到适当的基线功能是最重要的的。取得了良好的,分析的核磁共振光谱中的一个重要因素是提高信噪比。要做到这一点,确保最佳的“调整”和“垫片”的样本。在协议文本中提到,使用的标准样品前插入心脏,可以促进这项工作。这也有利于有足够规模的“样品”。心称量小于100毫克,通常提供较低的PCR和ATP的信号,所以采集时间的增加,将要获得良好的磷谱。
有几种方法可以修改现有的协议,以争取更多的信息,对心脏功能和能量。在我们的实验室,我们灌注混合衬底缓冲区,其中可以包括不同的组合(低,高浓度的)的脂肪酸,乳酸,酮体,和胰岛素的存在心中。稳定同位素在灌注缓冲区的使用(即,13 C标记的基板),我们所拥有的能力估计基质利用TCA循环标记的乙酰辅酶A的相对贡献 。5-7对于这种应用,我们执行isotopomer 13的C3 – 13的C4 -谷氨酸与13 C – NMR谱分析。这就要求冻结夹紧在灌注协议结束的心脏和执行冰冻组织提取。这将是一个额外的实验分析,需要使用不同的探头具有独立设置参数。其他应用包括缓冲区脱氧葡萄糖替代,同时监测随时间变化的2 -脱氧葡萄糖磷酸中使用的31 P核磁共振光谱的心脏的积累。这种方法允许7 8此外,我们的实验室分析心脏功能和能量灌注缺血/再灌注和高工作量的挑战组成的协议。,6,8-10心肌对葡萄糖的摄取测量。
总之,31 P NMR光谱在小鼠离体心脏是一个技术上具有挑战性的过程,需要使用先进设备。然而,它产生的数据是非常宝贵的研究人员希望分析生物工程小鼠模型的功能和能量。我们的实验室,这些技术已在心肌功能,能量和新陈代谢的各种压力所带来的后果的认识至关重要。1,11 ,12
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢她的支持,林恩斯宾塞在核磁共振光谱实验的部分。这项工作是由国家卫生基金R01 HL059246研究院,R01 HL067970,R01 HL088634(田博士)和F32 HL096284(博士Kolwicz)的赠款支持。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
Magnesium Sulfate | Reagent | Sigma Aldrich | M7506 |
EDTA | Reagent | Sigma Aldrich | E1644 |
Potassium chloride | Reagent | Sigma Aldrich | P4505 |
Sodium bicarbonate | Reagent | Sigma Aldrich | S6297 |
Sodium chloride | Reagent | Sigma Aldrich | S7653 |
Calcium chloride dihydrate | Reagent | Sigma Aldrich | C5080 |
D-Glucose | Reagent | Sigma Aldrich | G7528 |
Sodium Pyruvate | Reagent | Sigma Aldrich | P2256 |
Bruker Ultrashield 600WB Plus | Equipment | Bruker | |
PowerLab 4/30 | Equipment | ADInstruments | ML866/P |
LabChart 6 Pro | Equipment | ADInstruments | MLS260/6 |
Quad Bridge Amp | Equipment | ADInstruments | ML224 |
STH Pump Controller | Equipment | ADInstruments | ML175 |
Minipuls 3 Peristaltic Pump | Equipment | ADInstruments | ML172 |
Disposable BP Transducer | Equipment | ADInstruments | MLT0699 |
10mm NMR Sample Tube | Equipment | Wilmad LabGlass | 513-7PP-7 |
Polyethylene tubing PE10 | Equipment | Becton-Dickinson | 427401 |
Physiological Pressure Transducer | Equipment | ADInstruments | MLT844 |
Polyethylene tubing PE50 | Equipment | Becton-Dickinson | 427411 |
Micrometer syringe | Equipment | Gilmont Instruments | GS-1101 |
McPherson Forceps | Equipment | Miltex Inc. | 18-949 |
Castraviejo microscissors | Equipment | Roboz Surgical Instruments | RS-5650 |
Neoptix Signal Conditioner | Equipment | Neoptix, Inc. | Reflex – 1 |