Summary

Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren

Published: November 17, 2010
doi:

Summary

Hier präsentieren wir die intrakranielle Injektion von AAV-Vektoren für die Fluoreszenzmarkierung von Neuronen und Gliazellen in der Sehrinde.

Abstract

Intrakranielle Injektion von viralen Vektoren entwickelt, um ein fluoreszierendes Protein exprimieren ist eine vielseitige Kennzeichnung Technik zur Visualisierung von bestimmten Untergruppen von Zellen in verschiedenen Hirnregionen in vivo und in Hirnschnitten. Anders als die Injektion von Fluoreszenzfarbstoffen, bietet virale Kennzeichnung der gezielten Förderung einzelner Zelltypen und ist weniger teuer und zeitaufwendig ist als Einführung transgener Mauslinien. Bei dieser Technik wird ein Adeno-assoziierte Viren (AAV) Vektor injiziert intrakraniell mit stereotaktischen Koordinaten einer Mikropipette und eine automatische Pumpe für präzise Lieferung von AAV auf den gewünschten Bereich mit minimaler Schädigung des umliegenden Gewebes. Injection-Parameter können auf einzelne Experimente durch Anpassung der Tier-Alter an der Injektionsstelle, Injektion Lage, Injektionsvolumen, die Rate der Injektion, AAV-Serotyp und der Promotor, der die Genexpression zugeschnitten werden. Je nach den gewählten Bedingungen kann viral-induzierter Transgenexpression erlauben die Visualisierung von Gruppen von Zellen, einzelne Zellen oder feinen zelluläre Prozesse, bis auf die Ebene von dendritischen Dornen. Die hier gezeigten Experiment zeigt eine Injektion von doppelsträngiger AAV, die grün fluoreszierendes Protein für die Kennzeichnung von Neuronen und Gliazellen in der Maus primären visuellen Kortex.

Protocol

1. Virus Handhabung und Lagerung Richtiger Schutz und Umgang mit Techniken sollten auf der Grundlage der biologischen Sicherheit des Virus verwendet werden gewählt werden. Diese Praktiken können in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 5. Auflage, auf der CDC-Website gefunden werden ( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). Die Verwendung von AAV-Vektoren für Biosafety Level 1 (BSL-1) gen…

Discussion

Viral-vermittelte Gentransfer birgt ein großes Potenzial für die Untersuchung der neurologischen Prozesse und Behandlung von Störungen des Gehirns 1,2,3. Die große Vielseitigkeit dieser Technik kann auch genutzt werden, um Fluoreszenz-Label-Zellen für die Bildgebung sowohl in vitro und in vivo 4 sein. Hier zeigen wir ein detailliertes Verfahren für die Transduktion von Neuronen und Gliazellen in Maus visuellen Kortex mit einer doppelsträngigen Adeno-Verein Virus, das Enhanc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde ermöglicht durch Zuschüsse aus dem NIH (EY012977), ein Career Award in der Biomedizin von der Burroughs Wellcome Fund, der Whitehall-Stiftung, und die Sloan Foundation (AKM).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor   Stoelting 51625 Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm   Fine Science Tools 14084-08  
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved   Fine Science Tools 11152-10  
Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled   Fine Science Tools 11251-35 Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm   Fine Science Tools 11000-12  
Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece   Ram Products, Inc. TECH2000ON/OFF Dental drill
Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter   Fine Science Tools 19008-14  
Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul   VWR International/ Drummond 5-000-1001 or 53480-287  
Mineral oil   VWR International 29447-338  
Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)   World Precision Instruments, Inc. M3301-M3-R Used for determining stereotaxic co-ordinates
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller   World Precision Instruments, Inc. UMP3-1  
Sutures   VWR International 95056-952  
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller   Sutter Instruments P-97  
Tobradex       Available from your institution’s veterinary services

References

  1. Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O’Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
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Cite This Article
Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140, doi:10.3791/2140 (2010).

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