Een analytisch instrument-box voor de Uitgebreide Biochemische, structurele en Transcriptome Evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen
Summary
Biofilms gevormd op tandoppervlakken zijn zeer complex en worden blootgesteld aan een constante aangeboren en exogene milieu-uitdagingen, die hun architectuur moduleren, fysiologie en transcriptoom. We ontwikkelden een toolbox om de samenstelling, de structurele organisatie en gen-expressie van orale biofilms, die kan worden aangepast aan andere gebieden van de biofilm onderzoek te onderzoeken.
Abstract
Biofilms zijn zeer dynamisch, georganiseerd en gestructureerd gemeenschappen van microbiële cellen verstrikt in een extracellulaire matrix van de variabele dichtheid en samenstelling 1, 2. In het algemeen, biofilms ontwikkelen van de eerste microbiële beslag op een oppervlak gevolgd door de vorming van cel-clusters (of microkolonies) en de verdere ontwikkeling en stabilisatie van de microkolonies, die voorkomen in een complexe extracellulaire matrix. De meerderheid van de biofilm matrices haven exopolysacchariden (EPS), en tandheelkundige biofilms vormen hierop geen uitzondering, vooral die in verband met cariës ziekte, die meestal gemedieerd door mutans streptococcen 3. De EPS worden gesynthetiseerd door micro-organismen (S. mutans, een belangrijke bijdrage levert) door middel van extracellulaire enzymen, zoals glucosyltransferases gebruik van sucrose in de eerste plaats als substraat 3.
Studies van biofilms gevormd op tandoppervlakken zijn bijzonder uitdagend vanwege hun constante blootstelling aan milieu-uitdagingen in verband met complexe dieet-host-microbiële interacties die voorkomen in de mondholte. Beter begrip van de dynamische veranderingen van de structurele organisatie en de samenstelling van de matrix, fysiologie en transcriptoom / proteoom profiel van biofilm-cellen in reactie op deze complexe interacties verder zou vooraf de huidige kennis van hoe orale biofilms moduleren pathogeniteit. Daarom hebben we een analyse-tool-box om biofilm analyse te vergemakkelijken op structureel, biochemisch en moleculair niveau door een combinatie van algemeen beschikbare en nieuwe technieken met op maat gemaakte software voor data-analyse. Standaard analytische (colorimetrische assays, RT-qPCR en microarrays) en nieuwe fluorescentie technieken (voor simultane etikettering van bacteriën en EPS) werden geïntegreerd met specifieke software voor data-analyse van de complexe aard van de orale biofilm onderzoek adres.
De tool-box bestaat uit 4 verschillende, maar onderling verbonden stappen (figuur 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data-ingang, 3) Data Processing, en 4) data-analyse. We gebruikten onze in vitro biofilm-model en de specifieke experimentele omstandigheden op het nut en de flexibiliteit van de tool-box aan te tonen. De biofilm-model is eenvoudig, reproduceerbare en meerdere herhalingen van een enkel experiment kunnen gelijktijdig 4 worden gedaan, 5. Bovendien, is het mogelijk tijdelijk de evaluatie, de opname van verschillende micro-organismen 5 en beoordeling van de effecten van de verschillende experimentele condities (bijvoorbeeld behandelingen 6; vergelijking van de knock-out mutanten vs ouderlijke stam 5; koolhydraten beschikbaarheid 7). We beschrijven hier twee specifieke onderdelen van de tool-box, waaronder (i) nieuwe software voor microarray data mining / organisatie (MDV) en fluorescentie beeldvorming analyse (DUOSTAT), en (ii) in situ EPS-labeling. We bieden ook een experimentele geval zien hoe de tool-box kan u helpen met biofilms analyse, data-organisatie, de integratie en interpretatie.
Protocol
Discussion
In deze presentatie hebben we aangetoond dat twee cruciale onderdelen van de Analytische Tool-Box (EPS / bacteriën imaging en microarray data mining / verwerking), de veelzijdigheid en het nut van de verschillende testen geïntegreerd in het systeem. Het is duidelijk dat de tool-box vergemakkelijkt de uitgebreide (vergelijkende) en gelijktijdige analyse van de verschillende aspecten van de biofilms biochemie, architectuur en genexpressie in reactie op de verschillende experimentele condities met behulp van een in v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen dr. Gary Xie en Herbert Lee bedanken voor de ontwikkeling van de MDV. We danken ook Drs. Simone Duarte, Ramiro Murata, Jae-Gyu Jeon, Jacqueline Abranches, en mevrouw Stacy Gregoire van hun technische en wetenschappelijke bijdrage voor de analytische componenten van de tool-box. Dit onderzoek werd mede ondersteund door USPHS Research verlenen DE018023 van het National Institute of Dental en Craniofaciale Research.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | ||
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | ||
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | ||
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus, Tokyo, Japan |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Leme, P. a. e. s., Koo, A. F., Bellato, H., Bedi, C. M., G, J. A. C. u. r. y. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation–new insight. J Dent Res. 85, 878-887 (2006).
- Koo, H., Schobel, B. D., Scott-Annem, K., Watson, G., Bowen, W. H., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K. Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries. J Dent Res. 84, 1016-1020 (2005).
- Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).
- Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms. BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).
- Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development. PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).
- Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms. Methods Mol Biol. 666, 87-102 (2010).
- Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol. J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).
- Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).
- Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development. Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).
- Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).
- Xiao, J., Koo, H. Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms. J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).
- Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).
- Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r., Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >., Crielaard, W. Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms. J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).
