本方案描述了一种利用微孔板读数仪测量并分类土壤磷的高通量酶解法，可将土壤磷分为单酯磷、二酯磷和无机磷。在标准实验室中，可同时测定多达96个样品。
本文内容
摘要
摘要
环境样品中存在多种有机磷（P）分子1。传统的磷测定方法无法检测这些有机磷化合物，因为它们不与比色试剂发生反应2,3。酶促水解（EH）是一种新兴方法，可用于准确定性环境样品中的有机磷形态4,5。在准确性方面，该方法仅逊于磷-31核磁共振波谱法（31P-NMR），但后者成本高昂且需要专门的技术培训6。我们已将一种可测定三类磷（磷酸单酯P、磷酸二酯P和无机P）的酶促水解方法适配至微孔板读数系统7。该方法为研究人员提供了一种快速、准确、经济且操作简便的手段，可用于测定土壤、沉积物、粪肥中的磷形态，以及经浓缩后的水体样品。这是目前唯一可在常规实验室中进行的、用于测定有机磷形态及其酶可降解性的高通量方法。所得数据有助于科学家研究系统的养分含量及富营养化潜力。
方案
1. 磷的提取
- 配制1 L的0.25 M氢氧化钠（NaOH，40.00 g/mol）+ 0.05 M乙二胺四乙酸（EDTA，292.24 g/mol）溶液。
- 在50 mL锥形管中，将30 mL NaOH + EDTA溶液加入2 g湿土或干燥样品中。
- 在室温下振荡孵育16小时。
- 以3000 ×g离心3分钟。
2. 样品提取液 pH 值调节
- 取0.1 mL样品转移至1.5 mL微量离心管中。
- 加入0.017 mL 2.5 M乙酸、0.144 mL 0.4 M醋酸盐缓冲液（含70.5%醋酸钠 [CH3COONa, 82.03 g/mol] 和29.5%乙酸，pH 5.0）以及0.739 mL去离子水。
- 调节后提取液的终体积为1 mL，终pH值为5.0。
3. 酶母液的配制
- 配制 1 L 0.1 M 醋酸钠（CH3COONa，82.03 g/mol）溶液，pH 5.0。
- 在步骤3.1制备的醋酸钠缓冲液中，配制2份各10 mL的酸性磷酸酶储备液，使终浓度均为0.5单位/毫升。
I型酸性磷酸酶来自 Triticum aestivum （小麦胚芽；GP，通常为0.5 U mg-1 固体，EC 3.1.3.2）
IV-S型酸性磷酸酶 Solanum tuberosum （马铃薯；PP，通常为 4.6 U mg-1 固体，EC 3.1.3.2）
* 活性单位由供应商规定，其中1单位定义为每小时在溶液中释放1微摩尔正磷酸盐的量 37°C. - 重组冻干的核酸酶 P1（EC 3.1.30.1） Penicillium citrinum （真菌；NP1，通常为 500 U mg-1 固体）溶于1 mL去离子水中——此后可于 4°C 以备将来使用。
- 将NP1移液至3.2步骤中准备的10 mL离心管之一，使终浓度为2.5 Units/mL NP1；通过反复倒置数次轻轻混匀。
- 将两份10 mL酶溶液在3000 xg条件下离心30分钟。
4. P 标准曲线与对照
- 配制 1 L 的 1 mM 磷酸钾（K2HPO4，174.18 g/mol）储备液。
- 取 1 mL 上述 1 mM 磷酸钾储备液加入 1.5 mL 离心管中，并进行七次 0.5 mL 的连续稀释。
- 弃去第一支试管中的溶液，使剩余 7 个稀释梯度的磷含量范围为 20 nmol–0.625 nmol P。
- 将每支试管中的溶液各取 80 μL，重复加样至标准 96 孔板的 B–H 行。
- 向第 11 和 12 列的 A 行各加入 80 μL 醋酸钠缓冲液（第 3.1 节），作为 0 nmol P 的校准点。
- 此时第 11 和 12 列各包含 8 个无机磷酸盐参考样品，浓度范围为 0 nmol 至 20 nmol。
- 第 10 列将包含以下对照：
- 向第 10 列的前三个孔中各加入 40 μL PP+GP 酶溶液和 40 μL 醋酸钠缓冲液（第 3.1 节）。
- 向接下来的三个孔中各加入 40 μL PP+GP+NP1 酶溶液和 40 μL 醋酸钠缓冲液。
- 向其中一个孔加入含 10 nmol 葡萄糖-6-磷酸（C6H11Na2O9P • xH2O，304.1 g/mol）的醋酸钠溶液 40 μL 和 PP+GP 酶溶液 40 μL；向第 10 列最后一个孔中加入醋酸钠溶液代替酶溶液。
5. 样品与酶孵育
- 每个待测样品将占据标准96孔板中1行的前9个孔。
- 将第2节中pH调节后的样品提取液各40 μL分配至最多8行的1–9号孔中。
- 所有样品分配完成后*，使用多通道移液器将PP+GP酶溶液加入1–3列，PP+GP+NP1加入4–6列，醋酸钠缓冲液（第3.1节配制）加入7–9列。
*此步骤必须迅速完成，以确保所有样品的孵育时间相等。 - 用盖子盖好96孔板，将样品与酶溶液、对照组及标准曲线在37°C下准确孵育1小时。
6. 释放的和背景无机磷的比色法测定
- 用去离子水分别配制以下每种溶液各 50 mL：
溶液 A*：0.1 M 抗坏血酸（C6H8O6，176.12 g/mol）+ 0.5 M 三氯乙酸（Cl3CCOOH，163.39 g/mol）
溶液 B：0.01 M 钼酸铵（(NH4)2MoO4，196.01 g/mol）
溶液 C：0.1 M 柠檬酸钠（HOC(COONa)(CH2COONa)2 2H2O，294.10 g/mol）+ 0.2 M 亚砷酸钠（NaAsO2，129.91 g/mol）+ 5% 冰醋酸
（CH3CO2H，60.05 g/mol） * 溶液 A 必须每日新鲜配制。 - 使用多通道移液器迅速向 96 孔板的所有孔中加入 25 μL SDS 溶液、100 μL 溶液 A、20 μL 溶液 B 以及 50 μL 溶液 C。
- 盖上板子，在室温下孵育 30 分钟。
- 使用任意可调的微量板读数仪在 850 nm 处测定吸光度。
7. 磷化合物的分类
- 将原始数据导入电子表格应用程序（例如 Microsoft Excel）。
- 绘制无机磷标准曲线：以 x 轴表示 0 至 40 nmol P，y 轴表示吸光度重复测定值的平均值。
- 进行线性回归，求得最佳拟合直线的方程。
- 第 1–3 列：直接应用标准曲线——此为背景无机磷。
- 第 4–6 列：取样品三份测定值的平均值，并从总吸光度中减去对照组（酶溶液 + 背景无机磷）——此为来自可水解磷单酯的磷。
- 第 7–9 列：与第 5 步相同，但减去第 4–6 列的吸光度值——此为来自可水解磷二酯的磷。
- 利用标准曲线方程将吸光度数据转换为释放的 nmol P。
- 释放的 nmol P 可换算为原始土壤中每千克所含的 mg P。或者，分析各类磷所占比例也是数据分析的一种有效方法。
8. 代表性结果：
在比色反应完成后，对96孔板进行快速的目视检查，可为判断实验操作是否正确提供线索。首先通过观察酶标板侧面的液面高度，检查每个孔中的液体体积。所有孔中的试剂体积应恰好为275 μL。接下来，目视检查样品三复孔和标准品双复孔的颜色，这些技术复孔的颜色应为完全相同的蓝色色调。然后将标准曲线应用于含有葡萄糖-6-磷酸的两个孔，并确认其释放出全部10 nmol的无机磷。在使用ICP-OES或其他替代方法测定总提取磷含量后，需确保根据本方案计算出的总磷值不超过实际提取出的磷量。
注意：在电子表格中仔细管理数据有助于避免定量错误。由于需要同时处理大量数值，建立一个模板将是非常值得投入的时间。
图 1. 96 孔板显示 8 个样品（A-H 行）的结果以及标准曲线（第 11 和 12 列）。对照设在第 10 列。
第 1–3 列与第 4–6 列之间颜色强度的增加是由于单酯 P 化合物水解所致，第 4–6 列与第 7–9 列之间颜色强度的增加是由于二酯 P 化合物水解所致。
图 2. 利用高通量酶解法分析佛蒙特州土壤样品的 0.25 M NaOH-0.05 M EDTA 提取液中磷形态的分布。误差线表示标准偏差，n = 3。
讨论
由于该方法本身具有使用小体积样本快速操作的特点，因此需要格外小心。其中最关键的步骤是将溶液移液至板上的操作。准确且最重要的是保持一致的移液技术，这对于本检测的成功至关重要。
NaOH-EDTA 提取法可将许多样品中的大部分磷分为三类：正磷酸盐、单酯磷和二酯磷。含有 NaOH-EDTA 可提取性磷的土壤、粪肥、沉积物或任何其他环境样品均可采用该方法进行表征。环境样品中的磷形态不一定稳定，该技术可在样品降解前完成表征，且无需投入大量研究人员。
当需要处理大量样品时，该检测方法尤为适用。试剂用量和空间需求已缩减至可管理的水平（例如，使用1.5 mL微量离心管而非50 mL玻璃烧瓶）。这种改进还可减少废物的产生。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢美国地质调查局（USGS）和佛蒙特州水资源与湖泊研究中心提供资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| 冰醋酸 | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| 小麦酸性磷酸酶 | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| 马铃薯酸性磷酸酶 | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| 核酸酶 P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| 磷酸钾 | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| 葡萄糖-6-磷酸 | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| 钼酸铵 | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| 柠檬酸钠 | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| 砷酸钠 | Sigma-Aldrich | S9663 |
参考文献
- Turner, B. L., Frossard, E., Baldwin, D. S. Organic phosphorus in the environment. , Cabi Publishing. Wallingford. (2005).
- Murphy, J., Riley, J. P. A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Dick, W. A., Tabatabai, M. A. Determination of orthophosphate in aqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphorus compounds. J. Environ. Qual. 6, 82-85 (1977).
- He, Z., Toor, G. S., Honeycutt, C. W., Sims, J. T. An enzymatic hydrolysis approach for characterizing labile phosphorus forms in dairy manure under mild assay conditions. Bioresour. Technol. 97, 1660-1668 (2006).
- He, Z., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 36, 1373-1383 (2005).
- Cade-Menun, B. J. Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Talanta. 66, 359-371 (2005).
- Johnson, N. R., Hill, J. E. Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis. Soil Sci. Soc. Am. J. 74, 1786-1791 (2010).
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