레이저 Uncagable 플루오레신 Dextran과 Zebrafish 세포의 리니지 라벨
Summary
이 프로토콜은 uncaged 플루오레신에서 신호를 증폭하기 위해 immunolabeling 전체 산 뒤에 갇힌 플루오레신의 UV – uncaging를 사용하여 셀 zebrafish의 배아의 작은 그룹의 운명을 라벨 및 추적하는 방법을 delineates.
Abstract
발달 생물학의 중심 문제는 그들이 undifferentiated 엽 성의 전구 물질로부터 발생하는 등 척추 동물에있는 무수한 세포 유형의 출처를 알아낼 것입니다. 연구원은 DiI 상표 1 및 모델 시스템의 개발의 나중 단계에서 확인할 세포 운명을 추적 효소의 압력 주입이 같은 혈통 라벨의 다양한 방법을 고용했습니다. zebrafish (Danio rerio)의 첫 번째 운명의지도는 배아의 이산 지역에서 하나의 세포로 같은 rhodamine dextran과 같은 형광 염료의 주입에 의해 iontophoretic 조립 시간 동안 3-5 라벨 세포의 운명을 추적했다. 효과적인 반면,이 방법은 기술적으로 요구하고 일반적으로 zebrafish 실험실에서 찾을 수 없습니다 전문 장비가 필요합니다. 최근, 이러한 자외선에 노출되면 irreversibly 빨간색 형광 초록색에서 전환 에오스와 가에데로 photoconvertable 형광 단백질은, zebrafish 6-8 증가 사용을 볼 수 있습니다. zebrafish 배아와 transgenesis의 상대적 용이성의 광학 선명도는 혈통의 라벨에 대해 이러한 특히 매력적인 도구를 만들었습니다 그리고 생체내 7 세포의 마이 그 레이션을 관찰합니다. 그들의 유틸리티에도 불구하고,이 단백질은 염료 중재 혈통의 라벨 방법 몇 가지 단점을 비교합니다. 가장 중요한 우리는 이러한 단백질 photoconversion 동안 높은 3 – D 해상도를 얻기에서 발견 어려움이다. 이 빛 가운데, 아마도 zebrafish의 혈통 라벨에 대해 해상도와 사용 용이성에있어 최고의 조합 갇힌 플루오레신 dextran의 사용, 칭 그룹에 바인딩된 형광 염료를 만드는 마스크는 형광 9. 염료 다음은 형광 또는 면역의 시각화를 허용, 레이저 또는 수은 램프에서 자외선을 사용하여 특정 셀 내의 (담금질 그룹에서 발표) "uncaged"가 될 수 있습니다. iontophoretic 방법과는 달리, 우리에 갇힌 플루오레신은 표준 사출 apparatuses로 주입 수 있으며 핀홀 10 갖춘 epifluorescence 현미경으로 uncaged. 또한, 플루오레신에 대한 항체는 uncaged 양식을 감지하고, 에피토프는 고정 잘 남아 11. 마지막으로, 우리에 갇힌 플루오레신는 두 개의 광자 현미경은 12,13 고용 특히 경우, 매우 높은 3 – D 해상도 활성화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 갇힌 플루오레신 및 레이저 uncaging에 의해 혈통 라벨의 방법을 설명합니다. Subsequenctly, uncaged 플루오레신는 항체로 분류하여 같은 GFP와 같은 다른 epitopes와 동시에 검색됩니다.
Protocol
Discussion
설명한 바와 같이,이 프로토콜은 microinjection, 현미경, 그리고 immunofluorescence의 일반적으로 사용되는 기법을 기반 zebrafish에서 상대적으로 빠른 가계 라벨 방법을 제공합니다. 우리는 레이저화된 방식으로 플루오레신을 개방하다 가장 효율적이고 비용 효과적인 방법으로 uncaging 것으로 나타났습니다. 이 방법은 4 DPF 늦게 같은 실험 끝점과 혈통의 라벨을 사용할 수 있습니다. 그러나, 세포가 분열로 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 갇힌 플루오레신 만들기에 대한 도움을 댄 칼린 감사하고 싶습니다. 또한 우리는 다음과 자금 출처 감사의 말씀을 전합니다 : JAC에 발달 생물학 교육 그랜트를 위해 밴더빌트 대학 메디컬 스쿨 프로그램을, 그리고 NIH HD054534to JTG.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | ||
| Aminodextran, 10kDa | Invitrogen | D1860 | ||
| Zeba desalt spin columns | Pierce | 89889 | ||
| goat anti-fluorescein antibody | Invitrogen | A11095 | ||
| Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody | Invitrogen | A21082 | ||
| 35mmx10mm petri dishes | Becton-Dickinson | 351008 | ||
| Upright compound microscope with 40x water immersion objective | Leica | DM6000B | ||
| MicroPoint Manual Laser Illumination System | Photonic Instruments | |||
| Phenylthiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | ||
| Tricaine | Sigma | E10521 | ||
| Proteinase K | Roche | 03115836991 | ||
| Plastic thread | Any sewing supply store | |||
| Agarose | Research Products International | A20090 | ||
| SpeedVac | Thermo Scientific | Savant SPD131DDA | ||
| Vortexing mixer | VWR | Vortex Genie 2 | ||
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
References
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