의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온
Summary
의 신경근육학 교차로 (NMJ)<em> Drosophila melanogaster</em> 정상적인 시냅스 기능뿐만 아니라, 특정 신경 질환에서 발견 시냅스 기능 perturbations 공부를위한 중요한 모델 시스템입니다. 우리의 해부를위한 프로토콜을 제시<em> Drosophila</emNMJ 이내에 활성 영역 단백질에 대한> 애벌레 모터 시스템과 immunostaining.
Abstract
Drosophila 애벌레 신경근육학 교차점 (NMJ)은 시냅스 구조와 기능 연구를위한 훌륭한 모델입니다. Drosophila 잘 강력한 유전자 조작과 애벌레 신경계가 정상 기능뿐만 아니라 공부에 특히 유용합니다 입증되었습니다뿐만 아니라 perturbations의 용이성에 대한 알려져있다 그 일부 신경 질환 (로이드와 테일러, 2010)과 함께. Drosophila에서 발견된 대부분의 주요 시냅스 분자는 또한 포유류에서 발견된 대부분의 CNS는 포유류의 시냅스를 흥분성의 같은 Drosophila NMJ은 glutamatergic하고 활동을 종속적인 리모델링을 (코 외., 2000)을 보여줍니다 수 있습니다. 자신의 innervation 패턴 그것이 가능한 이러한 모터 뉴런과 신체 – 벽 근육 섬유 사이의 것과 식별 시냅스 터미널, 그들이 신경을 분포시키다 (Keshishian와 김, 2004). 공부를하고 틀에 박힌 및 반복되기 때문에 또한, Drosophila의 뉴런은 개별적으로 확인할 수 있습니다 유전과 물리적 조작의 용이성과 함께 evolutionarily 보존 버렸네 구성 요소의 존재는 시냅스 기능 (Budnik, 1996)을 기본 메커니즘을 조사하는 Drosophila 모델이 이상적입니다.
이들은 신경 전달 물질 방출의 사이트이기 때문에 시냅스 터미널에서 활성화된 영역은 특히 관심이 있습니다. NC82은 Drosophila 단백질 Bruchpilot (Brp), 활성 영역 (Wagh 외., 2006)의 중요한 구성 요소입니다 CAST1/ERC 가족 구성원을 인식 단클론 항체이다. Brp 직접 활성 영역 T – 바 형태로 표시하고 효과적으로 칼슘 2 클러스터링에 대한 책임이 + T – 바 밀도 아래 채널 (파우켓 외., 2009).했습니다 Brp의 돌연변이 칼슘이 많이 감소 + 채널 밀도, 우울 evoked 소포 릴리스 및 변경 단기 소성 (키텔 외., 2006). 활성 영역의 변경은 Drosophila 질환 모델에서 관찰되었습니다. 예를 들어, NC82 항체를 사용하여 immunofluorescence는 활성 영역 밀도가 루게릭병과 피트 – 홉킨스 증후군 (.; Zweier 외, 2009. Ratnaparkhi 외, 2008)의 모델로 감소되었다 것으로 나타났다. 따라서 질병의 Drosophila의 애벌레 모델에 적극적으로 지역 또는 기타 시냅스 단백질의 평가는 시냅스 결함의 존재에 대한 가치있는 초기 실마리를 제공할 수 있습니다.
NMJ의 immunofluorescence 분석을 위해 전체를 마운트 해부 Drosophila의 애벌레를 준비하는 것은 몇 가지 기술이 필요하지만, 약간의 연습이 가장 과학자들에 의해 수행할 수 있습니다. 발표는 각 유전자형 사이의 환경 차이를 제한하고 재현성 및 통계 분석에 대한 자신감을위한 충분한 동물을 제공 해부와 같은 해부 접시에 immunostained하는 여러 애벌레를 위해 제공하는 방법입니다.
Protocol
Discussion
뉴런은 시냅스 터미널 면적은 매우 중요하며, 사후 및 사전 신경 세포들 간의 적절한 의사 소통을위한 다리입니다. 질환 모델에서 신경 세포의 건강을 조사하기 위해 강력한 방법은 immunofluorescence에 의해 시냅스 터미널의 단백질을 분석하는 것입니다. 여기에 제시 immunofluorescence 방법은 집단 간의 환경 차이를 제한하는 동안 연구자가 동시에 많은 애벌레를 검사 수 있습니다. Drosophila 타사 i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 원고에 대한 그들의 도움이 덧글에 대한 박사 Nael Alami 박사 남 김성철 감사합니다.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
| Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
| Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments | 501778 | |
| Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
| Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |
References
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