Imagerie cellulaire en direct d'extrusion de l'épiderme du poisson zèbre développement
Summary
Cellules qui meurent sont extrudés à partir des tissus épithéliaux par la contraction concertée des cellules voisines, sans perturber la fonction de barrière. La clarté optique de développement du poisson zèbre offre un excellent système pour visualiser l'extrusion dans la vie épithéliums. Nous décrivons ici les méthodes d'induire et d'extrusion d'image dans l'épiderme zebrafish larvaire à une résolution cellulaire.
Abstract
L'entretien homéostatique des tissus épithéliaux exige le retrait continu des cellules endommagées, sans perturber la fonction de barrière. Nos études ont montré que les cellules meurent envoyer des signaux à leurs voisins en direct à la forme et le contrat d'un anneau d'actine et la myosine qu'elle éjecte hors de la feuille épithéliales lors de la fermeture des lacunes qui pourraient avoir résulté de sa sortie, un processus appelé extrusion 1 cellule. La clarté optique de développement du poisson zèbre offre un excellent système pour visualiser l'extrusion dans la vie épithéliums. Nous décrivons ici une méthode pour induire et d'extrusion d'image dans l'épiderme zebrafish larvaire. Pour visualiser l'extrusion, nous injectons une sonde protéine fluorescente rouge étiqueté pour la F-actine dans des embryons stade unicellulaire poisson zèbre transgénique exprimant la protéine fluorescente verte dans l'épiderme et induisent l'apoptose par addition de G418 pour les larves. Nous utilisons ensuite imagerie time-lapse sur un microscope confocal à disque rotatif pour observer la dynamique de l'actine et les comportements des cellules épithéliales au cours du processus d'extrusion cellulaire par apoptose. Cette approche nous permet d'étudier le processus d'extrusion en direct épithéliums et fournira une avenue à étudier les états pathologiques causés par le défaut d'éliminer les cellules apoptotiques.
Protocol
Discussion
Le protocole décrit ici montre une méthode simple et facile à visualiser le processus d'extrusion dans un tissu vivant épithéliales. Ce type d'expérience nous permet d'examiner les subtilités de la dynamique de l'actine pas auparavant appréciés dans les analyses de tissus fixés, et par conséquent, des compléments en commun des méthodes d'immunofluorescence. Nous pouvons utiliser ce protocole en combinaison avec des inhibiteurs chimiques ou mutants génétiques pour mieux analyser le proc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Rosenblatt pour des discussions scientifiques, des suggestions et commentaires. Nous tenons également à remercier Mary Halloran qui a gentiment fourni le plasmide codant pour DP-UtrCH et David Grunwald qui a fourni les CK: GFP transgéniques poisson zèbre. Merci également à Gretchen King et le personnel de la ressource centralisée au poisson-zèbre à l'Université de l'Utah pour l'entretien et les soins excellents du poisson-zèbre. Ce travail a été soutenu par le NIH Prix NIGMS directeur du NIH est une Innovateur Nouveau DP2 OD002056-01 à JR. GTE a été soutenu par le NIH multidisciplinaire du cancer du Programme de subventions de formation 5T32 CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
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