Aqui descritos são protocolos utilizados para visualizar o processo dinâmico de MG53 mediada por reparação de membrana celular em animais inteiros e em nível celular. Estes métodos podem ser aplicados para investigar a biologia das células do plasma resealing membrana e medicina regenerativa.
Reparação de lesão aguda para a membrana celular é um processo elementar de fisiologia celular normal, e com defeito de reparo de membrana tem sido associada a muitas doenças degenerativas humanas. A recente descoberta de MG53 como um componente chave da máquina resealing membrana permite um melhor entendimento molecular da biologia básica de reparação tecidual, bem como para potenciais aplicações translacional em medicina regenerativa. Aqui detalhamos os protocolos experimentais para explorar a função in vivo de MG53 no reparo de lesão muscular, utilizando protocolos de exercício em esteira em modelos de mouse, para testar a capacidade de reparação ex vivo de membrana, medindo entrada corante em fibras musculares isoladas, e para monitorar o processo dinâmico de MG53 mediada tráfico vesícula e reparação da membrana celular em células de cultura de células vivas usando microscopia confocal.
Esteira rolante é uma metodologia útil no fornecimento de uma carga de exercícios para os animais tratados. Como uma metodologia para medir a função muscular ou da capacidade de resistência é uma abordagem notoriamente barulhentos que é difícil de executar de uma forma consistentemente reprodutíveis 8. Em geral, os tempos até a exaustão pode ser usado como um ponto final para resolver diferenças importantes entre os grupos experimentais, tais como aquelas entre algumas linhas e camundongos knockout rato do tipo selvagem 9. Manipulações experimentais que produzem diferença mais sutil, como alguns ensaios farmacêuticos, não pode resolver as diferenças acima do ruído associado a essa técnica. A fim de maximizar a reprodutibilidade ea sensibilidade destas técnicas é importante para manter as condições para uma sessão para outra de muito perto. A hora do dia os animais são exercidas, bem como as condições de aquecimento período utilizado, são fatores importantes e devem permanecer consistentes de julgamento para julgamento.
Efeitos estirpe pode ter impacto significativo sobre o projeto de protocolos de esteira como certas cepas de camundongos pode funcionar por muito mais tempo na esteira do que outras linhagens e respondem diferentemente ao exercício de resistência 10. Como orientação geral, muitos ratos será capaz de executar 200-300 metros no total, em um estudo de exaustão com constante aumento na velocidade da esteira (5 velocidade m / m inicial com 1 m / m adicionado por cada minuto após o início). Para um exercício de resistência dos ratos pode ser executado entre 9 a 12 m / m por 30 minutos 2 ou 3 vezes por semana. No entanto, estudos individuais geralmente requerem alguma otimização do protocolo para corresponder às necessidades individuais experimental.
O procedimento de danos UV laser tem demonstrado ser um método eficaz para medir a capacidade de reparação da membrana das fibras musculares esqueléticas 3,6,11. Um componente vital para o sucesso desses experimentos é a utilização de fibras musculares que exibem apenas uma linha reta, a aparência da haste em forma com um padrão regular de estrias e um sarcolema lisa que não aparece enrugada. Se outras fibras musculares são selecionados dano à membrana pode já estar presente nestas fibras e interpretação dos resultados desses experimentos pode ser complicado. Também é importante que a orientação da fibra e definição da região irradiada os definidos na Figura 1. Isto proporciona uma lesão de tamanho reprodutível, permitindo a comparação entre as fibras. Se a região definida de lesão está completamente dentro da fibra, uma lesão interna será criado ao invés de interromper o sarcolema. Além disso, o valor calculado para ΔF / F 0 é muito sensível para a região de interesse selecionada para a medição de fluorescência média. Uma área de aproximadamente 200μm 2, adjacentes, e incluindo o local da lesão, é adequado. Ao contrário da região definida por lesão, esta área deve estar completamente dentro da fibra. Se você incluir espaço fora da fibra, resultando em branco a área vai aumentar ΔF / F 0 em fibras com entrada pouco de corante, reduzindo ΔF / F 0 em fibras com um fenótipo mais grave. Isso diminui a sensibilidade do ensaio, fazendo comparação entre as fibras mais difícil.
Para o ensaio danos micropipeta, o ângulo entre o micropipeta e prato fundo de vidro deve ser de aproximadamente 45 graus, a fim de efetivamente dano à membrana celular. As células foram escolhidos por danos micropipeta devem ser bem colocado no fundo do prato e células arredondadas não deve ser usado desde muito provavelmente eles vão separar após micropipeta cutucando. Experimentos permeabilzation saponina são menos exigentes tecnicamente e relativamente rápido para executar comparação com micropipeta ensaios de penetração. No entanto, há várias limitações a danos saponina, incluindo a apenas uma célula pode ser usado por prato desde saponina será difusa e danos outras células que prato.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | |
70 % ethanol | ISC Bioexpress | |
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments | |
2 mg/ml collagenase type I | Sigma | |
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick or equivalent | |
Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 |
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Zeiss | |
FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | |
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 |
Micropipette puller | Sutter Instruments | model P-97 |
3 axis micromanipulator | Narishige | MHW-3 |
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | BioRad | MHW-3 |
Saponin | Sigma | 47036 |