Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Summary

Kultur von normalen Zellen in ihrer dreidimensionalen Kontext stellt eine alternative Methode zur frühen Ereignisse für die zelluläre Transformation und Tumorentstehung erforderlich studieren. Diese Methode wird verwendet, um normale Eierstock-und Eileiter Zellen wachsen zu frühen Ereignisse bei Eierstockkrebs Bildung zu studieren.

Abstract

Eierstockkrebs ist die fünfthäufigste Todesursache bei Krebserkrankungen bei Frauen und hat eine 63% Sterberate in den USA ^1. Der Zelltyp Ursprungsbezeichnungen für Eierstockkrebs ist nach wie vor in Frage und könnte entweder die Eierstöcke Oberflächenepithel (OSE) oder die distale Epithel der Eileiter Fimbrien ^2,3 sein. Die Kultivierung der normalen Zellen als primäre Kultur in vitro wird den Wissenschaftlern ermöglichen, spezifische Änderungen, die an Eierstockkrebs in den verschiedenen Epithel führen, könnte damit endgültig der Bestimmung der Zelltyp des Ursprungs-Modell. Dies ermöglicht die Entwicklung von genaueren Biomarker, Tiermodelle mit Gewebe-spezifische Gen-Veränderungen und eine bessere Präventionsstrategien gezielt für diese Krankheit.

Die Aufrechterhaltung normaler Zellen in Alginat-Hydrogele fördert kurzfristig in vitro-Kultur von Zellen in ihrer dreidimensionalen Kontext und ermöglicht Einführung von Plasmid-DNA, siRNA, und kleine Moleküle. Durch Kultivierung Organe in Stücke, die von der strategischen schneidet mit einem Skalpell, verschiedene Kulturen aus einem einzigen Organ erzeugt werden kann, eine Erhöhung der Anzahl von Experimenten von einem einzigen Tier stammen. Diese Kürzungen Modell Aspekte des Eisprungs, die zu Proliferation der OSE, die mit Eierstockkrebs Bildung verbunden ist. Zelltypen wie der OSE, die nicht wachsen auch auf Kunststoffoberflächen können kultiviert mit dieser Methode werden und erleichtern Untersuchung normale zelluläre Prozesse oder die frühesten Ereignisse in der Entstehung von Krebs ^4.

Alginat-Hydrogele können verwendet werden, um das Wachstum vieler Arten von Geweben ^{5-Unterstützung} sein. Alginat ist ein lineares Polysaccharid aus sich wiederholenden Einheiten von β-D-Mannuronsäure und α-L-Guluronsäure, die mit Calcium-Ionen vernetzt werden können, was zu einer sanften Gelier-Aktion, die nicht beschädigt Gewebe ^6,7 zusammensetzt. Wie andere dreidimensionale Zellkultur Matrices wie Matrigel, bietet Alginat mechanische Unterstützung für Gewebe, jedoch sind Proteine ​​nicht reaktiv mit dem Alginat-Matrix und somit Alginat dient als synthetische extrazelluläre Matrix, die nicht einleitet Zellsignalisierung ^5. Das Alginat Hydrogel schwebt in Standard-Zellkulturmedium und unterstützt die Architektur des Gewebes Wachstum in vitro.

Eine Methode ist für die Vorbereitung, Trennung und Einlagerung von Eierstock-und Eileiter Orgelstücke in Alginat-Hydrogele, die in Kultur gehalten werden bis zu zwei Wochen vorgestellt. Die enzymatische Freisetzung von Zellen für die Analyse von Proteinen und RNA-Proben aus dem Organ Kultur wird ebenfalls beschrieben. Schließlich ist das Wachstum der primären Zelltypen ohne genetische Immortalisierung von Mäusen möglich und erlaubt Ermittler knockout und transgenen Mäusen verwenden.

Protocol

1. Eierstockkrebs Dissektion und Gewebe isoliert Bereiten Sie eine 0,5% (w / v) Lösung von Natriumalginat, aus einer modifizierten Version des Protokolls vorzubereiten zuvor beschrieben 5, mit sterilem PBS und Hitze bis 37 ° C. Mix durch Umdrehen oder rockig, aber nicht vortexen. Zeichnen Sie das Alginat in eine 1 ml Spritze mit einer 25 G Nadel und halten bei 37 ° C. Bereiten 10mM sterile CaCl 2-Lösung für die Vernetzung der Alginat auf Gewebe Verkapselung und warm bis 37…

Discussion

Die Entwicklung eines dreidimensionalen Organkultursystem Nutzung Alginat-Hydrogele stellt eine vielseitige Methode für die Analyse von vielen verschiedenen Gewebetypen aus einer Vielzahl von Organismen. Der Einsatz von 3D-Kulturen können die Felder des Tissue Engineering und der regenerativen Medizin erweitert werden, da sie ein Gerüst, auf dem Zellen ¹¹ wachsen kann zur Verfügung stellt. Derzeit ist unser Labor unterzogen erste Studien mit menschlichen Eierstock-und Eileiter Gewebe, aber Kultur der mens…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Leibovitz L-15 medium	Gibco	11415
αMEM medium	Gibco	12000-022
Sodium alginate	Novamatrix
Sodium cacodylate	Sigma Aldrich	C0250
Polypropylene mesh fiber	McMaster Carr		45″ wide roll; 0.0041″ opening
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Penicillin/streptomycin	Gibco	15070-063
Alginate lyase	Sigma Aldrich	A1603
A1603	Sigma Aldrich	C9697	From Clostridium histolyticum
Bovine serum albumin	MP Biomedicals	103700
Fetal bovine serum	Gibco	Gibco
ITS solution	Roche	11074547001	Insulin/transferrin/sodium selenite
Cytokeratin 8 antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-1	Use at 1:200
DAPI	Vector Labs	H1200
Bromodeoxyuridine	Sigma	B50002-1G	Final concentration 10 μM