HIV感染患者との経験：末梢血中の細菌叢のシーケンシング
Summary
私たちの実験では、HIV陽性患者の末梢血中に転位細菌種のシークエンス解析を実行する方法を説明します。
Abstract
健康な消化管は、生理的体液性および細胞性粘膜免疫系の1,2の開発に影響を与える共生微生物の多種多様によって植民地化されている。
微生物叢は、強力な粘膜関門を介した免疫系から遮蔽されている。感染症と抗生物質は、通常の消化管の障壁と3つの可能な免疫異常につながることが常駐細菌の構成、両方を変更することが知られています。
HIVは、全身免疫活性化4-7を貢献する、リポ多糖と細菌のDNA断片のような細菌のバイオ製品、、の全身循環への粘膜免疫と漏れの進行性破壊と消化管バリアの侵害を引き起こします。微生物の転座は、HIV /エイズ免疫病原性と治療4,8への応答に関与している。
我々は、HIV感染患者の末梢血中に転位細菌の組成を特徴づけることを目的とした。私たちの目的を追求するために我々は、シークエンス解析に続いてpanbacteric 16S ribosomial遺伝子のPCR反応をセットアップします。
簡単に言えば、両方のHIV感染と健常人全血が使用されます。健常者が正常な腸内恒常性を提示することを考えるとフローラのは転座は、これらの患者に期待されていません。静脈穿刺および血漿分離によって全血採取に続いて、DNAは血漿から抽出し、panbacteric 16S ribosomial遺伝子9用の幅広い範囲のPCR反応を実行するために使用されます。以下のPCR産物の精製、クローニングとシークエンシング解析を実施しています。
Protocol
HIVに感染した血液サンプルの取り扱いが重要な推奨事項が必要です。 血液のすべての標本は、堅牢な漏れ防止のコンテナで輸送する必要があります。コンテナの外装のと試料に付随する事務処理の汚染を避けるために標本を収集する際には注意が必要です。 感染した血液を処理するすべての者は、手袋を着用する必要があります。手袋が変更され、手は、検体処理の完了後に洗浄?…
Discussion
<p class="jove_content">我々はここにHIV感染者の末梢血中の細菌の転座を特徴づけるためにPCR /シーケンシングプロトコールを示す。</p><p class="jove_content"edta含有チューブに集められた血漿を使用するときに>最も信頼性の高い結果が得られる。採血後、血漿が溶血し、DNA断片の劣化を避けるために、2 / 3時間以内に遠心分離によって分離されるべきである。サンプルは-80℃で、約5日間と℃、-20℃で最初に格納さ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、ビデオの製作と優秀な支援のためのジャンニシモーネに感謝しています。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Easty-DNA Kit | Invitrogen | K 180001 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7203 | |
| UltraPure Waer | Invitrogen | 10977049 | |
| Lysozyme | Fluka | 62970 | 10 μg/mL in Distillated Water |
| AmpliTaq Gold | Applied Biosystem | 26478701 | |
| Microcon 100 | Millipore | 42413 | |
| PCR primers | Invitrogen | ||
| Agarose | Eppendorf | C1343 | |
| DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| Purelink PCR micro kit | Invitrogen | K310050 | |
| LB Agar, powder | Invitrogen | 22700025 | |
| Bactoagar | Invitrogen | ||
| Ampicillin | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL in Distillated Water |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL in DMF |
| IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM in Distillated water |
| Topo TA cloning kit | Invitrogen | K450002 | |
| Purelink Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen | K210010 | |
| Big dye | Applied Biosystem | 4337455 | |
| DyeEx 2.0 spin kit | Qiagen | 63204 |
References
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).
- Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease. Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).
- Brenchley, J. M. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).
- Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe. Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).
- Jiang, W. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).
- Marchetti, G. Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy. AIDS. 22, 2035-2038 (2008).
- Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. , (2010).
- Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).
Tags
SequencingBacterial MicrofloraPeripheral BloodHIV-infected PatientsGastrointestinal TractCommensal MicrobesMucosal Immune SystemMicrobiotaImmune AbnormalitiesBreach In The Gastrointestinal BarrierMucosal ImmunitySystemic CirculationBacterial BioproductsLipopolysaccharideBacterial DNA FragmentsSystemic Immune ActivationMicrobial TranslocationHIV/AIDS ImmunopathogenesisResponse To TherapyCharacterise The Composition Of Bacteria Translocating In Peripheral BloodPCR ReactionPanbacteric 16S Ribosomal GeneSequencing Analysis
Cite This Article
Merlini, E., Bellistri, G. M., Tincati, C., d’Arminio Monforte, A., Marchetti, G. Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients. J. Vis. Exp. (52), e2830, doi:10.3791/2830 (2011).