Sequenziamento di microflora batterica nel sangue periferico: la nostra esperienza con pazienti affetti da HIV
Summary
Il nostro esperimento mostra come eseguire una analisi di sequenziamento di specie batteriche translocating nel sangue periferico di pazienti HIV positivi.
Abstract
La salute del tratto gastrointestinale è fisiologicamente colonizzate da una grande varietà di microbi commensali che influenzano lo sviluppo del umorale e cellulare 1,2 mucose del sistema immunitario.
Microbiota è protetta dal sistema immunitario attraverso una forte barriera mucosale. Infezioni e antibiotici sono noti per alterare la barriera sia normale tratto gastrointestinale e la composizione dei batteri residenti, che può causare possibili anomalie immunitarie 3.
HIV provoca una breccia nella barriera gastrointestinale con insufficienza progressiva di immunità mucosale e perdite nella circolazione sistemica di bioprodotti batteriche, come lipopolisaccaride e frammenti di DNA batterico, che contribuiscono ad attivazione immunitaria sistemica 4-7. Traslocazione microbica è implicato in HIV / AIDS immunopatogenesi e risposta alla terapia 4,8.
Abbiamo voluto caratterizzare la composizione dei batteri translocating nel sangue periferico di pazienti affetti da HIV. Per perseguire il nostro scopo abbiamo istituito una reazione di PCR per il gene 16S ribosomiale panbacteric seguita da una analisi di sequenziamento.
In breve, il sangue intero da entrambi i soggetti con infezione da HIV e sano viene usato. Dato che gli individui sani presentano normale omeostasi intestinale non traslocazione della microflora è atteso in questi pazienti. Dopo il prelievo di sangue intero da prelievo venoso e la separazione del plasma, il DNA è estratto dal plasma e utilizzato per eseguire una vasta gamma di reazioni PCR per il gene 16S ribosomiale panbacteric 9. Seguenti analisi purificazione PCR prodotto, la clonazione e il sequenziamento vengono eseguite.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Gianni Scimone di assistenza eccellente, con fare video.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Easty-DNA Kit | Invitrogen | K 180001 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7203 | |
| UltraPure Waer | Invitrogen | 10977049 | |
| Lysozyme | Fluka | 62970 | 10 μg/mL in Distillated Water |
| AmpliTaq Gold | Applied Biosystem | 26478701 | |
| Microcon 100 | Millipore | 42413 | |
| PCR primers | Invitrogen | ||
| Agarose | Eppendorf | C1343 | |
| DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| Purelink PCR micro kit | Invitrogen | K310050 | |
| LB Agar, powder | Invitrogen | 22700025 | |
| Bactoagar | Invitrogen | ||
| Ampicillin | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL in Distillated Water |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL in DMF |
| IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM in Distillated water |
| Topo TA cloning kit | Invitrogen | K450002 | |
| Purelink Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen | K210010 | |
| Big dye | Applied Biosystem | 4337455 | |
| DyeEx 2.0 spin kit | Qiagen | 63204 |
References
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