体内 电穿孔转染发育中小鼠视网膜

摘要

一种将质粒DNA导入小鼠视网膜细胞以开展功能获得或功能缺失研究的方法 体内 该方法利用外加电场诱导细胞质膜通透性发生的瞬时增加。

摘要

在哺乳动物视网膜发育过程中表达的基因功能表征仍是一项重大挑战。通过基因靶向技术构建组成型或条件型功能缺失敲除模型，成本高、耗时长，且需要大量人力。此外，视网膜中表达的基因可能在视网膜外具有重要功能，因此采用敲除策略时可能导致非预期的干扰因素。此外，在功能获得实验中异位表达某个基因的能力，对于探究其在细胞命运决定和/或终末分化中的作用具有极高价值。

我们介绍一种通过电穿孔将DNA质粒快速高效地导入新生小鼠视网膜的方法。施加高于特定场强的短时电脉冲可导致细胞质膜通透性瞬时增加，从而促进物质跨膜转移 ^1,2,3,4开创性研究证明，电穿孔可通过诱导形成亲水性细胞膜孔，使高电荷DNA分子穿越脂质双分子层，从而实现将基因导入哺乳动物细胞。 ⁵持续的技术发展使得电穿孔作为一种方法具有了可行性 体内 包括视网膜在内的多种小鼠组织中的基因转移，其方法在本文中予以描述 ^{6, 7, 8, 9, 10}.

将DNA溶液注射到新生（P0）小鼠视网膜下腔，使DNA位于视网膜色素上皮与视网膜之间，随后使用镊子电极施加电脉冲。小鼠眼睛的侧位分布有利于镊子电极轻松定位，实现负极-DNA-视网膜-正极的必要排列。转移基因的广泛整合与表达可在出生后第2天（P2）检测到。由于视网膜细胞缺乏显著的侧向迁移，因此会形成电穿孔区域与非电穿孔区域。在适当情况下，非电穿孔区域可作为内部组织学对照。

视网膜电穿孔可用于在泛表达启动子（如 CAG）驱动下表达基因，或利用 shRNA 构建体或 Cre 重组酶破坏基因功能。通过设计带有细胞特异性基因启动子的构建体，可实现更精确的表达定位。电穿孔细胞的可视化可通过表达 GFP 的双顺反子构建体，或共电穿孔一个 GFP 表达构建体来实现。此外，可同时电穿孔多个构建体，以研究基因间的组合效应，或实现不同基因的同步过表达与功能缺失。视网膜电穿孔还可用于基因组顺式调控元件的分析，方法是构建相应的表达载体及缺失突变体。此类实验可用于鉴定足以或必需介导细胞特异性基因表达的顺式调控区域¹¹。实验的潜在应用仅受限于构建体的可获得性。

方案

1. 电穿孔质粒的制备

电穿孔所需的DNA浓度为5μg/μl。通常需要使用Maxi-prep（Qiagen）或等效方法扩增所需质粒，随后对DNA进行纯化并浓缩至工作浓度。以下步骤描述了将DNA制备至工作浓度的过程。

1. 取100 μg DNA（来自Maxi-prep或等效方法），加水稀释至100 μL，以便操作。
2. 加入苯酚；苯酚的用量应根据DNA与总体积的比例计算，使DNA/体积比约为60%（μg DNA:总体积），例如：100 μg DNA（溶于100 μL）加入67 μL苯酚（100 μg:167 μL）。充分混匀；避免反复吹打，以免造成DNA过度剪切。
3. 在室温下以14000 RPM离心5分钟。
4. 收集上清液，按照步骤1.2中的DNA与总体积比例加入氯仿；按步骤1.2所述方式混匀，然后在室温下以14000 RPM离心5分钟。
5. 收集上清液，向DNA溶液中加入相当于上清液体积10%的3 M乙酸钠，轻轻混匀，再加入相当于上清液体积2.5倍的100%乙醇。通过颠倒混匀。DNA应在混匀过程中从溶液中沉淀析出。
6. 在4°C、14000 RPM条件下离心10分钟。
7. 用350 μL 70%乙醇洗涤沉淀，在4°C、14000 RPM下离心5分钟。
8. 将沉淀空气干燥，然后用1×PBS（细胞生物学级）溶解DNA至浓度为5 μg/μL。切勿过度干燥样品，否则将....

讨论

体内电穿孔是一种快速且高效的方法，可用于将DNA表达质粒转染至视网膜细胞。该方法使实验者能够通过在普遍表达的启动子控制下异位引入目的基因，开展基因功能获得性研究；或通过使用靶向目的基因的shRNA构建体，开展基因功能缺失性研究。此外，可同时电穿孔多个DNA质粒，使实验者能够分析多个基因的效应，或在引入第二个目的基因的同时敲低某一基因。当存在带有floxed目的基因的动物时，还可利用驱动Cre重组酶表达的质粒电穿孔，以嵌合方式消除基因表达。该方法对于区分基因的内在功能与外在功能尤为有价值。相反，在传统基因敲除小鼠的视网膜中电穿孔回目的基因，则可使实验者开展挽救实验，尝试逆转在基因敲除中观察到的表型。可根据具体研究需求，使用任意遗传背景的小鼠品系进行电穿孔。然而，若条件允许，最好选用母性行为较强的品系，例如Swiss Webster或CD1，以尽量降低电穿孔后仔鼠被母鼠遗弃的可能性。白化实验小鼠品系更易于操作，因为在显微注射过程中DNA溶液的扩散可被清晰观察。而眼内色素较深的品系（如C57BL/6J）则更具挑战性，因为Fast Green示踪剂难以与视网膜色素上皮的色素区分开来。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
缓冲液饱和酚	Invitrogen	15513-039	N/A
氯仿	JT Baker	9180-03	N/A
醋酸钠	JT Baker	3470-05	3 M 储存液
亮蓝FCF	Fisher Scientific	BP123-10	10 % 储存液
异丙醇棉片	Tyco Healthcare, Covidien	6918	N/A
30号针头	Terumo Medical Corp.	SG2-3013	N/A
Exmire 微量注射器	Ito Corporation	MS*E05	N/A
Tweezertrode（镊子电极）	BTX Technologies	522	N/A
电穿孔仪（电穿孔装置）	BTX Technologies	ECM 830	N/A
O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	4583	N/A