In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina
Summary
Eine Methode für die Einbeziehung von Plasmid-DNA in murinen Zellen der Netzhaut zum Zwecke der Durchführung entweder gewinnen oder Verlust der Funktion Studien<em> In vivo</em> Vorgestellt. Diese Methode nutzt die vorübergehende Erhöhung der Durchlässigkeit der Zelle Plasmamembranen durch die Anwendung eines äußeren elektrischen Feldes induziert.
Abstract
Die funktionelle Charakterisierung von Genen während der Säugetier-Retina-Entwicklung ausgedrückt bleibt eine große Herausforderung. Gene-Targeting, um konstitutive oder bedingten Verlust der Funktion Knockouts generieren bleibt Kosten-und arbeitsintensiv, wie auch zeitaufwendig. Zusätzlich zu diesen Herausforderungen, ausgedrückt Netzhaut Gene können wesentliche Aufgaben außerhalb der Netzhaut, was zu unbeabsichtigten verwirrt, wenn sie eine Knockout-Ansatz. Darüber hinaus kann die Fähigkeit zur ektopisch Ausdruck eines Gens in einer gain of function Experiment extrem wertvoll sein, wenn versucht wird, eine Rolle in Zellschicksal Spezifikation und / oder terminale Differenzierung zu identifizieren.
Wir stellen eine Methode zur schnellen und effizienten Einbau von DNA-Plasmiden in das Neugeborenen-Maus Netzhaut durch Elektroporation. Die Anwendung von kurzen, elektrischen Impulsen über einem bestimmten Feldstärke ergibt sich ein vorübergehender Anstieg der Plasma-Durchlässigkeit der Membran, die Erleichterung der Übertragung von Material durch die Membran 1,2,3,4. Bahnbrechende Arbeiten zeigten, dass der Elektroporation als Methode des Gentransfers in Säugerzellen könnte durch Induktion der Bildung von hydrophilen Plasmamembran Poren erlauben den Durchtritt von hoch geladenen DNA durch die Lipid-Doppelschicht 5 genutzt werden. Kontinuierliche technische Entwicklung hat in der Lebensfähigkeit der Elektroporation als Methode zur in-vivo-Gentransfer in mehreren Maus Gewebe einschließlich der Netzhaut, die Methode für die hier 6, 7, 8, 9, 10 ist beschrieben, geführt.
DNA-Lösung wird in den subretinalen Raum injiziert, so dass DNA zwischen dem retinalen Pigmentepithel und Netzhaut des Neugeborenen (P0) Maus und elektrische Impulse gesetzt ist, sind unter Verwendung einer Pinzette Elektrode. Die seitliche Stellung der Augen in der Maus erlaubt die einfache Ausrichtung der Pinzette Elektrode, die notwendigen Minuspol-DNA-Retina-Pluspol Ausrichtung. Umfangreiche Einarbeitung und Ausdruck der übertragenen Gene können durch postnatalen Tag 2 (P2) identifiziert werden. Durch das Fehlen eines signifikanten seitlichen Migration von Zellen in der Netzhaut sind elektroporiert und Nicht-elektroporiert Regionen erzeugt. Non-elektroporiert Regionen können als interne histologischen Kontrollen gegebenenfalls zu dienen.
Retinal Elektroporation kann ein Gen unter einem allgegenwärtigen Promotor, wie CAG auszudrücken, oder um Genfunktionen mittels shRNA Konstrukte oder Cre-Rekombinase stören. Weitere gezielte Expression kann durch die Gestaltung Konstrukte mit Zell-spezifische Gen-Promotoren erreicht werden. Visualisierung von elektroporierten Zellen erfolgt über bicistronischen Konstrukte, die GFP oder durch Co-Elektroporation einem GFP-Expressionsvektor zu konstruieren. Darüber hinaus können mehrere Konstrukte für die Untersuchung von kombinatorischen Gen-Effekte oder die gleichzeitige Gewinn und Verlust der Funktion von Genen elektroporiert werden. Retinal Elektroporation kann auch für die Analyse von genomischen cis-regulatorische Elemente durch die Erzeugung geeigneter Expressionskonstrukte und Deletionsmutanten eingesetzt werden. Solche Experimente können verwendet werden, um cis-regulatorische Regionen ausreichend oder für zellspezifische Genexpression 11 erforderlich zu identifizieren. Mögliche Experimente sind nur durch bauen die Verfügbarkeit begrenzt ist.
Protocol
Discussion
In-vivo-Elektroporation stellt eine schnelle und effiziente Methode für die Transformation von Zellen der Netzhaut mit DNA-Expressionsplasmide. Diese Methode ermöglicht es dem Experimentator zu gain of function Studien ektopisch ein Gen von Interesse unter der Kontrolle eines ubiquitär exprimierten Veranstalter oder Verlust der Funktion Studien mit shRNA Konstrukte gezielt Gene von Interesse wahrnehmen können. Darüber hinaus können mehrere DNA-Plasmide gleichzeitig elektroporiert werden, so dass der Exper…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH R01EY020560-01 und von einer WM Keck Young Scholar in Medical Research Award finanziert. Die Autoren bedanken sich bei Joseph Bedont für seine Unterstützung danken, bei der Abbildung der Netzhaut Präparate und Injektionen.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Buffer Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| Chloroform | J.T. Baker | 9180-03 | N/A |
| Sodium Acetate | J.T. Baker | 3470-05 | 3 M stock |
| Fast Green FCF | Fisher Biotech | BP123-10 | 10 % stock |
| Isopropyl alcohol prep | Tyco Healthcare | 6918 | N/A |
| 30-guage needle | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire microsyringe | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode (tweezer electrode) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | 522 | N/A |
| Electro Square Porator (electroporator) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek USA | 4583 | N/A |
References
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