Microiontophoresis需要在电势之间的内部和外界的微的差异,从一个微离子的运动。生物活性分子,从而交付的电流成比例。我们说明结合显微研究在微循环内皮依赖性血管舒张的乙酰胆碱microiontophoresis。
Microiontophoresis需要通过微管尖端的电流通过溶质在指定的网站内,提供一个实验的准备。 Microiontophoresis可以模拟提供到神经元再现2的神经递质和神经肽的突触传递的 1 。可以忽略不计容积(液)的位移,避免了机械扰动的实验准备。改善微循环3适应这些技术,使血管扩张和血管收缩的机制,在微观层面,在 体内 4,5的研究。一个关键的优势是对等的本地化交付使血管舒缩研究没有唤起全身或自反血压和组织血流量的变化,从而揭示了内在属性的微血管内微血管网络的定义站点的反应。
的microiontophoresis限制,传递到感兴趣的网站的代理的精确浓度是难以确定6。然而,其释放的微量提示是成正比的强度和持续时间的弹射目前2,7,这样,重复性的刺激-反应关系可以很容易确定的实验条件下定义(如下所述) 。影响微电泳交付的其他因素包括其在溶液中的溶质浓度和电离。内部的微管尖端直径应〜1微米或更小,以尽量减少扩散的“漏”,可以用护电流抵消。因此,向外(正)目前用于弹出保留内微阳离子和负电流。
微量的制备是促进了先进的电子车夫。微量移液器含有灯丝,玻璃毛细管拉成的微尖的“芯”的解决方案,从后端(“回填”)填补。这样做是通过插入microcapillary管连接注射器的微腔的兴趣和退出的解决方案解决方案。 Micromanipulators启用所需的微量安置在实验的准备。可以放置一个可移动的基础上安装Micromanipulators各地的准备,根据地形的微血管网络(下文)。
本议定书演示到一个鼠标提睾肌准备的动脉(见相关的协议:朱庇特的ID#2874),产生内皮依赖性血管舒张的乙酰胆碱microiontophoresis(乙酰胆碱+ CL – )。刺激同步交付使用电子触发与数字化图像采集。 Cx40 BAC – GCaMP2转基因小鼠9的使用,使细胞内钙离子反应,在生活改善微循环的底层在动脉内皮细胞的血管舒张的可视化。
这里所描述的协议表明准备和实施microiontophoresis微量的方法。乙酰胆碱的交付是用来说明在麻醉小鼠的动脉钙信号基本内皮依赖性血管舒张功能。我们的结果表明,乙酰胆碱增加microiontophoresis微量电流(图3)弹射力度内皮细胞钙荧光增加距离。乙酰胆碱缺乏休息的条件下的荧光增加,表示可以忽略不计,从微渗漏。缺乏应对降至100 nA刺激的强度(图3,传说)说明,内皮细胞钙增加所需的刺激阈值强度。这些技术可以很容易地适应其他血管活性药物和组织准备。
实际考虑:microiontophoresis工作研究动脉反应,几件事情应该得到承认。虽然它已被证明难以确定实际交付激动剂浓度,刺激 – 反应曲线之内和之间的准备重现。这些都可以通过脉冲持续时间不变(例如,500毫秒)和不同的弹射电流(例如,250,500和1000 NA;图3)。此外,弹射目前可以保持不变(例如,500 NA)和脉冲持续时间不同(例如,250,500和1000毫秒)。对于定义的激动剂浓度的行动,准备可以灌流合适的解决方案5。由于溶质的弹射动力,是电荷的运动,要交付的代理人必须携带的净电荷从微流离失所。为了确保代理人的利益是主要的电荷载体,它溶解在高浓度(例如,对乙酰胆碱的1男),以尽量减少电渗。当这需要操纵微量填充液的pH值,车辆的控制规定,以确定任何非特异性影响。适当的控制,也应单独通过的电流进行(例如,用充满生理盐水的微量)。代理其网站发布的扩散的有效距离应该是确定的,是最容易消失的一种生理反应(如血管扩张,或在细胞内钙离子的乙酰胆碱后弹射上升)由经验的微量定位于定义目标站点的距离。在实践中,有效扩散距离是很大的影响,如何定位在组织的微尖;例如,如果压入的组织和其尖端的技巧是闭塞,比弹射受损。过度的结缔组织是特别麻烦,应该从组织表面除去,在手术准备。也应注意给消耗的指定代理商的一角的可能性。这是尽量减少使用相对短的脉冲(例如,≤1秒)。持续电流(例如,几秒钟),激动剂可能被开除的提示更迅速地超过它可以从散装油中的微解决方案扩散所取代。
因为微不足道的体积是流离失所与microiontophoresis,如果之一是试图以改变的地方离子环境(例如,以提供一个极化K +刺激),可以有效地实现与microiontophoresis但是很容易的压力散装液体所需的弹射实现组成。一个动脉的局部刺激,内部直径为2-3微米的微管提示的工作以及与弹射压力4-5磅(28-35千帕)和脉冲持续时间(如1秒)控制一个电磁阀10。持续提供从微量到微血管代理是必需的,最好是使用适当的内部尖端直径(例如,〜10微米)11,12微量压力弹射。静水列的已知与活塞阀的高度提供了一种廉价的,良好定义的恒定压头开/关。流速由枪头和驾驶压力内径。一如往常,车辆控制是必不可少的,以排除非特异性的压力弹射行动。
The authors have nothing to disclose.
作者实验室的研究是由美国国立卫生赠款R37 – HL041026,R01 – HL086483和R01 – HL056786(SSS)和F32 – HL097463和T32 – AR048523由美国公共卫生服务(PB)研究院的支持。
Material Used | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | model P-97 | |
Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
5 ml syringe | Becton-Dickinson Co. | 309603 | |
Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
3-axis micromanipulator | Siskiyou Design Instruments | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments | Model 260 | |
trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8″ X 12″ X 12″ | According to design |
Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |