كفاءة توصيل الجينات في الجهاز العصبي المركزي متعددة باستخدام الأراضي في الرحم Electroporation
Summary
electroporation في الرحم تسمح للتسليم في الجين سريعا مكانيا وزمانيا الطريقة التي تسيطر عليها في النظام العصبي المركزي النامية (CNS). نحن هنا وصف للتكيف كبيرة في بروتوكول electroporation الرحم التي يمكن استخدامها لتوفير بنيات التعبير في عدة مجالات CNS الجنينية ، بما في ذلك الدماغ البيني ، telencephalon والشبكية.
Abstract
القدرة على التعامل مع التعبير الجيني هو حجر الزاوية في علم الأجنة التجريبية الحديثة اليوم ، مما أدى إلى الكشف عن مسارات تنموية متعددة. العديد من التقنيات المعدلة وراثيا قوية وراسخة متاحة لمعالجة مستويات التعبير الجيني في الفأر ، مما يسمح للجيل كل من الخسارة وكسب نماذج من بين وظيفة. ومع ذلك ، وتوليد الجينات الماوس على حد سواء مكلفة وتستغرق وقتا. طرق بديلة لمعالجة الجينات وبالتالي كان مطلوبا على نطاق واسع. electroporation في الرحم هو وسيلة لتوصيل الجينات في الأجنة الحية الماوس 1،2 أننا تكيفت بنجاح 3،4. ويستند إلى حد كبير على نجاح في مجال تكنولوجيات electroporation البيضة التي يشيع استخدامها في الفرخ 5. باختصار ، يتم حقن الحمض النووي في البطينين مفتوحة من الدماغ النامية وتطبيق التيار الكهربائي يؤدي تشكيل مسام عابرة في أغشية الخلايا ، مما يسمح لامتصاص الحمض النووي في الخلية. في أيدينا ، يمكن electroporated بكفاءة الأجنة في وقت مبكر اليوم الجنينية (E) 11.5 ، في حين أن استهداف الشباب الأجنة تتطلب الموجات فوق الصوتية الموجهة microinjection البروتوكول ، كما هو موضح سابقا 6. على العكس ، E15.5 هو آخر مرحلة يمكننا electroporate بسهولة ، ويرجع ذلك إلى ظهور تمايز الجبهي الجداري والعظام ، مما يعوق microinjection في الدماغ. في المقابل ، يمكن الوصول إليها من خلال شبكية العين نهاية مرحلة التطور الجنيني. ويمكن جمع الأجنة في أي نقطة زمنية طوال فترة ما بعد الولادة أو الجنينية المبكرة. حقن بناء مراسل يسهل التعرف على الخلايا transfected.
حتى الآن ، في الرحم وقد electroporation الأكثر استخداما لتحليل تطور القشرة المخية الحديثة 1،2،3،4. واستهدفت المزيد من الدراسات الأخيرة الجنينية 7،8،9 الشبكية والمهاد 10،11،12. هنا ، فإننا نقدم في تعديل بروتوكول electroporation الرحم التي يمكن تكييفها بسهولة لاستهداف مجالات مختلفة من الجهاز العصبي المركزي الجنينية. ونحن نقدم أدلة على أن باستخدام هذه التقنية ، فإننا يمكن أن تستهدف telencephalon الجنينية ، والدماغ البيني الشبكية. وتعرض نتائج ممثلة ، والتي تبين لأول مرة استخدام هذا الأسلوب لإدخال الحمض النووي في بنيات التعبير البطينين الوحشي ، مما يسمح لنا لرصد نضوج السلف ، والتمايز والهجرة في telencephalon الجنينية. نعرض أيضا أنه يمكن استخدام هذه التقنية لاستهداف الحمض النووي إلى الأراضي المحيطة الدماغ البيني البطين الثالث 3 ، والسماح للطرق الهجرة من الخلايا العصبية في التفريق نوى الدماغ البيني ليتم رصدها. أخيرا ، وتبين لنا أن استخدام micromanipulators يسمح لنا أن نقدم بدقة يبني الحمض النووي في المناطق المستهدفة الصغيرة ، بما في ذلك الفضاء تحت الشبكية ، مما يسمح لنا لتحليل آثار التلاعب الجيني على التنمية في شبكية العين.
Protocol
Discussion
ويمكن أن تستخدم في الرحم electroporation لتحليل مجموعة واسعة من العمليات التنموية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الجينات مراسل ترنسفكأيشن مثل GFP ، الفوسفاتيز القلوية mCherry أو لإجراء التجارب وتتبع نسب الهجرة العصبية. بدلا من ذلك ، يمكن لجنة المساواة العرقية recombinase أعرب ع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر إيفا Hadzimova ، بيار مطر وكوفاش كريستوفر لعملهم في تأسيس الأولي في مجال تكنولوجيا electroporation الرحم في المختبر CS. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) منحة (MOP 44094) وCIHR / مؤسسة مكافحة العمى (FFB) الناشئة فريق غرانت (00933-000) لخدمات العملاء والأطفال ألبرتا مستشفى بحوث المنحة لمؤسسة DMK. كان مدعوما من قبل RD الأمل CIHR المنح الدراسية وكندا ، ومعتمد من قبل الصليب الأحمر دراسية لFFB وكان مدعوما من قبل LML منحة تدريبية في علم الوراثة CIHR وتنمية الطفل.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Category |
|---|---|---|---|
| Fine scissors | Fine Science Tools Inc. | 14078-10 | Surgical Tools |
| Iris scissors, curved | Fine Science Tools Inc. | 14061-10 | Surgical Tools |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Fine Science Tools Inc. | 12002-12 | Surgical Tools |
| Ring forceps, 9mm | Fine Science Tools Inc. | 11103-09 | Surgical Tools |
| Eye dressing Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11051-10 | Surgical Tools |
| Dumont #7 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont #5 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11251-30 | Surgical Tools |
| Tissue forcep-Adson | Fine Science Tools Inc. | 11027-12 | Surgical Tools |
| Reflex Clip Applier | World Precision Instrument | 500343 | Surgical Tools |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Fine Science Tools Inc. | 10370-18 | Surgical Tools |
| Autoclip Remover | Mikron | 427637 | Surgical Tools |
| Silk Black Braided Suture | Ethicon Inc. | K871 | Surgical Tools |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | World Precision Instruments | 500346 | Surgical Tools |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | VWR-CanLab | 58018-004 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P7 | Instruments |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CA62111-488 | Instruments |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CAACCESS (misc.) | Instruments |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | VWR CanLab | CA33995-534 CPN-952-118 | Instruments |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Sutter Instrument, Carsen Group Inc. | P-97 | Instruments |
| Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-78-10 | Instruments |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Carl Zeiss Canada Inc. | M-152 | Instruments |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | World Precision Instruments | M1 | Instruments |
| Steel Base Plate for micromanipulator | World Precision Instruments | 5052 | Instruments |
| Micropipette Holder | World Precision Instruments | MPH3 | Instruments |
| Micropipette Handle | World Precision Instruments | 5444 | Instruments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | Instruments |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | Instruments |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Metrex Research Corporation | 10-8100 | Surgical Reagents |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Sigma Aldrich | G1264 | Surgical Reagents |
| Germex for sterilizing surgical tools | Vétoquinol | DIN# 00141569 | Surgical Reagents |
| BNP ophthalmic ointment | Vétoquinol | DIN# 00516414 | Surgical Reagents |
| Nair® | Distributed by Church & Dwight Co., Inc. | commercially available | Surgical Reagents |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | Surgical Reagents |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Schering-Plough | 531-535 | Surgical Reagents |
| Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | Surgical Reagents |
| Lactated Ringer Solution | Baxter Corporation | DIN# 0061085 | Surgical Reagents |
| Saline – 0.9% sodium chloride | B-Braun Medical Inc. | DIN# 01924303 | Surgical Reagents |
| Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | DIN# 02237518 | Surgical Reagents |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Surgical Reagents |
References
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Langevin, L. M. Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236. , 1273-1286 (2007).
- Mattar, P. Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity. Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Vue, T. Y. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Buffo, A. Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).
