אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

Abstract

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה יקר מנוצל כדי למקם / לדמיין ביטוי חלבון בסעיף רקמה רכוב באמצעות נוגדנים ספציפיים. קיימות שתי שיטות: השיטה הישירה והעקיפה. בניסוי זה, נוכל רק לתאר את השימוש מכתים IHC עקיף. העקיפים מכתים IHC מנצל מאוד ספציפיות נוגדנים משני הראשי ביוטין, מצומדות. נוגדנים ראשי מנוצלים discretely לזהות חלבונים עניין באמצעות קשירה epitope מסוים, ואילו נוגדנים משני לחסר עבור מכתים הלא ספציפית רקע להגביר את האות על ידי יצירת קומפלקסים כדי נוגדן הראשוני. שקופיות יכול להיות שנוצר חלקים קפואים, או חלקים פרפין מוטבע רכוב על שקופיות הזכוכית. בפרוטוקול זה, אנו דנים על הכנת פרפין משובצים קטעים ידי הידרציה dewaxing, באמצעות שיפוע אלכוהול, אחזור המושרה חום אנטיגן, וחסימת פעילות peroxidase אנדוגני ולא אתרי קישור ספציפיים. סעיפים חלקם מוכתמים אז עם נוגדנים ספציפיים עבור סמן תא T CD8 ו בעוד אחרים הם מוכתם עבור hydroxylase טירוזין. מגלשות מטופלים לאחר מכן עם נוגדנים משני המתאים מצומדות כדי ביוטין, שפותחה לאחר מכן ניצול avidin-מצומדות peroxidase חזרת (HRP) עם Diaminiobenzidine (DAB), כמו המצע. בעקבות פיתוח, מגלשות הם counterstained עבור לעומת זאת, ועלה תחת coverslips עם permount. לאחר ייבוש נאותה, מגלשות אלה אז מוכן הדמיה.

Protocol

מכתים סעיפים פרפין Dewax שקופיות עם קסילן (פישר X3 S -4) 3x 5 דקות כל אחד (קסילן לשנות מדי חודש בהתאם לשימוש, קסילן הוא רעיל). השתמש מנות מכסה במשך 20 שקופיות פישר נ"צ 08-812-1A ו racks עשה כדי להתאים את הכלים האלה. 200 מ"ל נוזלים לכל מאכל. מימה דרך שיפוע אלכוהול כדלקמן (שינוי הדרגתי כל 2 שבועות): 2x באתנול 100% (פישר # A406-20) עבור כל 2 דקות 2x באתנול 95% עבור כל 2 דקות 1x באתנול 70% עבור 2 דקות 1x באתנול 50% עבור 2 דקות 1x באתנול 30% עבור 2 דקות 1x DDH 2 O 2 דקות משרים DPBS דקות 5 (DPBS = פוספט שונה של Dulbecco בופר עם Ca 2 + ו – Mg 2 +). Antigen התאוששות: מחממים את מאגר Na-ציטראט (10 מ"מ, ה-pH 6.5) במיקרוגל. מבשלים את השקופיות עבור 15 דקות במיקרוגל. השקופיות לא צריך לבדוק כל כך יבש דקות ולהוסיף Na-ציטראט בעת הצורך. בואו מגניב בטמפרטורת החדר. חסימת פעילות peroxidase אנדוגני עם 1% H 2 O 2 ב DPBS במשך 20 דקות (1.5 מ"ל של המניה 30% סיגמא H-1009 ב DPBS 50 מ"ל). משרים 5 דקות DPBS 3 x. בלוק הלא ספציפית באתרים דוגרים על ידי לילה ב 4 מעלות צלזיוס DPBS + 5% שור בסרום אלבומין (BSA) + 0.1% אזיד Na + 5% בסרום. הערה: בחירת נסיוב יהיה תלוי מין שבו נוגדנים המשמשים מכתים נעשו. בלוק עם סרום מן המינים שבו אב משני (מצומדות כדי ביוטין) התקבלה. אם זה אינו זמין, להשתמש בסרום של זן שונה מזה שבו Ab העיקרית נעשתה. חסימת האתרים ביוטין עם avidin / ביוטין חסימת Kit (וקטור מעבדות קטלוג # SP-2001): דגירה עם Avidin D במשך 15 דקות. לשטוף קצר עם DPBS. דגירה עם פתרון ביוטין במשך 15 דקות. מדגירים את Ab העיקרי 2 שעות בטמפרטורת החדר, ב DPBS + 2% + BSA NaAzide 0.1% + 2% בסרום (זהה עבור חסימת צעד). משרים 5 דקות PBS 3 x. דגירה עם Ab המשני מצומדות עם ביוטין שעה 1 בטמפרטורת החדר DPBS + 2% + 0.1% BSA Na אזיד + 2% בסרום (כמו משמש צעד חסימה). הכן מגיב ABC באותו זמן כי יש לפתח דקות לפחות 30 לפני השימוש! (ראה חומרים) הכינו צינור חרוטי 50 מ"ל. בשנת 15 DPBS מ"ל (ללא נסיוב, לא אזיד) להוסיף 3 טיפות של מגיב, לערבב ולהוסיף 3 טיפות של B מגיב ומערבבים. הימנע לסחוט את הבקבוקים, אלא לחכות טיפות כדי ליצור בכוחות עצמם. ABC ערכת Vectastain PK-6100 מ-Vector Labs. משרים 5 דקות DPBS 3 x. דגירה עם מגיב ABC עבור 30-45 דקות בטמפרטורת החדר. משרים 5 דקות DPBS 3 x. הכנת המצע DAB peroxidase (וקטור Labs # SK-4100) ב 5 מ"ל DDH 2 O בבקבוקון זכוכית מיד לפני השימוש (ראה חומרים) 2 טיפות של תמיסת למלאי, לערבב 4 טיפות של DAB, לערבב (צריך להיות מעט חום) 2 טיפות H 2 O 2, לערבב זרוק את המצע DAB על גבי שקופיות ולצפות עבור כתמים חומים. טובלים שקופיות לקרח + ברז כדי לעצור את התגובה. יש לשטוף תחת מי ברז קרים למשך 5 דקות. Counterstain עם Hematoxylin (20 שניות; פישר CS401-D) ולשטוף במי ברז עד שהמים מגיע ברורה החוצה. מייבשים דרך שיפוע אלכוהול החל אתנול 30% עד 100% אתנול (2 דק 'כל אחד). משרים קסילן דקות 3 x 5. הר עם Permount (פישר # SP15-100): לשים כמה לעיל בסעיף בשקופית ולחץ לאט על הקטע עם coverslip ללא בועות אוויר. אל תזיז את coverslip עד יבש לחלוטין, אשר לוקח ~ 24 שעות.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Xylene		Fisher	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol		Fisher	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS				Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer				10 mM, pH 6.5
H2O2		Sigma	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution				DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide				NaAzide
avidin/biotin blocking kit		Vector laboratories	SP-2001
Ab buffer				DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100		Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate		Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin		Fisher	CS401-D	counterstain
Permount		Fisher	SP15-100
Slides and cover-slips				glass