التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum</em
Summary
هنا ، نحن تصف تفصيلا التصوير الخلية الحية أساليب التحقيق الكيميائي. نقدم أساليب مضان المجهري لرصد ديناميات spatiotemporal من الأحداث يشير في الخلايا المهاجرة. قياس الأحداث يشير يسمح لنا أن نفهم كذلك كيف شبكة النوع من الاختزال ، يشير يحقق التدرج الاستشعار من chemoattractants وضوابط الهجرة الاتجاه من الخلايا حقيقية النواة.
Abstract
ويمكن الكشف عن العديد من الخلايا حقيقية النواة التدرجات الاشارات الكيميائية في بيئاتهم ، وترحيل 1 تبعا لذلك. ويشار إلى هذه الهجرة كما قاد الخلية الكيميائي ، وهو أمر ضروري للخلايا مختلفة لتنفيذ وظائفها مثل الاتجار الخلايا المناعية والخلايا العصبية الزخرفة 2 ، 3. عائلة كبيرة من البروتين G – مستقبلات مقترنة (GPCRs) بالكشف عن الببتيدات الصغيرة متغير ، والمعروفة باسم chemokines ، لتوجيه الهجرة خلية في الجسم الحي 4. الهدف النهائي للبحث الكيميائي هو أن نفهم كيف يمكن لchemokine التدرجات GPCR آلات الحواس وإشارات التحكم الأحداث التي أدت إلى الكيميائي. GPCR بوساطة لتحقيق هذه الغاية ، ونحن نستخدم تقنيات التصوير للمراقبة ، في الوقت الحقيقي ، وتركيزات spatiotemporal الحركة chemoattractants الخلية ، في التدرج من جاذب كيميائي ، وتفعيل heterotrimeric البروتين G ، وإشارات بين الخلايا المشاركة في الأحداث الكيميائي للخلايا حقيقية النواة 5-8 . الكائن بسيطة حقيقية النواة ، Dictyostelium discoideum ، يعرض chemotaxic السلوكيات التي هي مماثلة لتلك الكريات البيض ، ودال. discoideum هو نظام نموذجي لدراسة مفتاح الكيميائي حقيقية النواة. كما حرر المعيشة الأميبات ، D. الخلايا في الانقسام discoideum المتوسط الغنية. عند الجوع ، والخلايا إدخال برنامج التنموي الذي والتجميعية من خلال cAMP في بوساطة الكيميائي لتشكيل هياكل multicullular. وقد تم تحديد العديد من العناصر المشتركة في الكيميائي إلى مخيم في دال discoideum. الربط من المخيم إلى GPCR (cAR1) يدفع تفكك heterotrimeric G – البروتينات إلى وحدات فرعية Gγ Gβγ 7 و 9 و 10. Gβγ مفارز تنشيط رأس ، والذي ينشط في PI3K بدوره تحويل PIP 2 إلى 3 PIP على غشاء الخلية 11-13. 3 PIP بمثابة مواقع ملزم للبروتينات مع التماثل pleckstrin (PH) المجالات ، وبالتالي توظيف هذه البروتينات إلى غشاء 14 و 15. تفعيل مستقبلات cAR1 يتحكم أيضا في الجمعيات غشاء PTEN ، التي dephosphorylates PIP PIP 2 3 إلى 16 و 17. يتم الحفاظ تطويريا الآليات الجزيئية في الكيميائي GPCR chemokine بوساطة الخلايا البشرية مثل العدلات 18. نقدم الطرق التالية لدراسة الكيميائي د. discoideum الخلايا. 1. إعداد الخلايا المكون الكيميائي. 2. التصوير الكيميائي للخلايا في الانحدار المخيم. 3. تراقب تفعيل GPCR الناجم عن heterotrimeric G – البروتين في الخلايا الحية واحد. 4. تصوير جاذب كيميائي عن العوامل الدينامية PIP 3 الردود في الخلايا الحية واحد في الوقت الحقيقي. ويمكن تطبيق أساليب التصوير المتقدمة لدينا لدراسة الكيميائي من الكريات البيض البشرية.
Protocol
Discussion
العمليات للوصول إلى مرحلة من الخلايا المختصة الكيميائي
لنوع البرية D. discoideum الخلايا ، فإنه يأخذ حوالي 5 ~ 6 ساعات ينبض التنمية في درجة حرارة الغرفة لدفعهم الى مرحلة جيدة الكيميائي المختصة خلال الخلايا التي تعرض التشكل جيدا الخل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويؤيد هذا العمل من قبل صندوق جماعية من NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes | ||
| cAMP | Sigma | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Zeiss | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
References
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
- Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
- Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
- Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
- Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
- Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3′ kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
- Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
- Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 .
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
- Haastert, P. J. V. a. n., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).
