L'augmentation des rendements d'ADNc de cellule unique quantités d'ARNm dans les réactions de laboratoire standard de la transcriptase inverse en utilisant Microstreaming acoustique

Summary

Nous décrivons une nouvelle méthode pour augmenter le rendement d'ADNc de cellule unique quantités d'ARNm dans les réactions de laboratoire standard de transcription inverse contraire. La nouveauté réside dans l'utilisation d'un micromélangeur, qui utilise le phénomène de la microstreaming acoustique, de mélanger les liquides à l'échelle du microlitre plus efficacement que secouer, vortex ou trituration.

Abstract

L'expression des gènes en corrélation avec le comportement des cellules est idéalement effectué au niveau unicellulaire. Cependant, ce n'est pas facile à réaliser car la petite quantité d'ARNm labiles présents dans une seule cellule (1-5% de 1-50pg ARN total, soit 0,01 2.5pg-ARNm, par cellule ¹⁾ dégrade la plupart du temps avant qu'elle puisse être une transcription inverse dans une copie d'ADNc stables. Par exemple, en utilisant des réactifs de laboratoire standard et matériel, seul un petit nombre de gènes peut être évaluée qualitativement par cellule ^2. Une façon d'augmenter l'efficacité de la norme de laboratoire de la transcriptase inverse (RT) des réactions (réactifs standard dans des volumes microlitre) comprenant une seule cellule quantités d'ARNm serait plus rapide mélanger les réactifs pour l'ARNm peut être converti en ADNc avant qu'il ne se dégrade. Toutefois, ce n'est pas anodin car à l'échelle du microlitre écoulement du liquide est laminaire, c'est à dire les méthodes actuellement disponibles de mélange (c'est à dire secouer, vortex et trituration) ne parviennent pas à produire suffisamment de mouvement chaotique efficacement mélanger les réactifs. Pour résoudre ce problème, micro-échelle des techniques de mélange doivent être utilisées ^3,4. Un certain nombre de technologies basées sur microfluidiques mélange ont été développés avec succès d'augmenter les rendements de réaction RT ^5-8. Cependant, les technologies microfluidiques nécessitent du matériel spécialisé qui est relativement cher et n'est pas encore largement disponibles. Une solution moins coûteuse, plus pratique est souhaitable. L'objectif principal de cette étude est de démontrer comment l'application d'un roman "micromélange" technique de laboratoire standard réactions RT comprenant une seule cellule quantités d'ARNm augmente considérablement leurs rendements d'ADNc. Nous trouvons des rendements d'ADNc augmenter d'environ 10 à 100 fois, ce qui permet: (1) un plus grand nombre de gènes à analyser par cellule; (2) une analyse plus quantitative de l'expression des gènes, et (3) une meilleure détection des gènes de faible abondance dans des cellules individuelles. Le micromélange est basé sur acoustiques microstreaming ^9-12, un phénomène où les ondes sonores se propageant autour d'un petit obstacle créer un débit moyen près de l'obstacle. Nous avons développé une acoustique microstreaming basée sur l'appareil («micromélangeur") avec une simplification clés; microstreaming acoustiques peuvent être obtenus à des fréquences audio en s'assurant que le système a une interface liquide-air avec un petit rayon de courbure ^13. Le ménisque d'un volume microlitre de solution dans un tube fournit un rayon suffisamment petit de courbure. L'utilisation des fréquences audio signifie que le matériel peut être peu coûteux et polyvalents ^13, et des acides nucléiques et d'autres réactifs biochimiques ne sont pas endommagés comme ils peuvent être avec sonicateurs de laboratoire standard.

Protocol

1. Micromélange une réaction de RT Avant d'effectuer une réaction de RT avec micromélange, à équilibrer le micromélangeur à la température désirée de la réaction de RT. Placez le dans un micromélangeur 37 ° C (ou la température recommandée par le fournisseur RT) incubateur pour au moins 1 heure avant le début de la réaction de RT. Mettre en place le mix RT en fonction de la transcriptase inverse du fournisseur (par exemple, MMTV-RT de Promega, Omniscript de Q…

Discussion

La méthode d'application de la norme de laboratoire micromélange réactions RT décrites ici peuvent, bien sûr, impliquent l'ARNm récoltés par n'importe quelle méthode (par exemple des cellules de lyse, microdissection laser de capture). Il peut également comprendre toute les marques ou les types de réactifs RT, n'importe quelle température (dans la tolérance des matériaux de l'micromélangeur), et toute période de temps. Par exemple, nous avons observé l'amélioration des rendements…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices
PicoPure RNA Isolation Kit	Arcturus, CA, USA	KIT0204	The kit is now available from Applied Biosystems
DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents	Ambion	AM1906M
Random hexamer primers	Promega	C1181
AMV-RT	Promega	M5101
dNTP set	Promega	U1240
RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega	N2111
Nuclease-Free Water	Promega	P1193
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystem	4309155
Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotometer.	Thermo Scientific
Corbett Rotor Gene RG-6000	Corbett Life Science		Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008