As células pluripotentes humanas estaminais (hPSCs) têm o potencial para tratar uma miríade de diferentes doenças. A utilidade destas células reside no facto de que eles podem diferenciar-se em qualquer tipo de célula no corpo. Descrevemos aqui o ensaio teratoma, que é usado para demonstrar a pluripotência das hPSCs.
As células estaminais pluripotentes (PSC) têm a característica única que eles podem diferenciar em células de todas as três camadas germinais. Isto torna-os de uma ferramenta potencialmente útil para o tratamento de muitas doenças diferentes. Com o advento das células pluripotentes induzidas estaminais (iPSCs) e pesquisa de continuar com células estaminais embrionárias (hESCs), há uma necessidade de ensaios que possam demonstrar que uma linha de células particular é pluripotentes. Transmissão germinativa tem sido o padrão ouro para demonstrar a pluripotência das células-tronco embrionárias do rato (MESC) linhas 1,2,3. Utilizando este ensaio, os investigadores podem mostrar que uma linha de MESC pode fazer todos os tipos de células no embrião incluindo células germinativas 4. Com a geração de linhas humano ESC 5,6, o ensaio apropriado para provar pluripotência destas células era clara, uma vez CES humanos não podem ser testados para a transmissão da linha germinativa. Como um substituto, o ensaio de teratoma é actualmente utilizado para demonstrar a pluripotrência de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) 7,8,9. Embora este ensaio tem vindo recentemente sob escrutínio e novas tecnologias estão sendo ativamente explorados, o ensaio de teratoma é o padrão ouro atual 7. Neste ensaio, as células em questão são injectados um rato imune comprometida. Se as células são pluripotentes, um teratoma desenvolverá eventualmente e secções do tumor irá mostrar tecidos a partir de todas as 3 camadas germinais 10. No ensaio de teratoma, hPSCs pode ser injetado em diferentes áreas do mouse. Os locais de injecção mais comuns incluem a cápsula testículo, a cápsula do rim, o fígado, ou para a perna por via subcutânea ou por via intramuscular 11. Descrevemos aqui um protocolo robusto para a geração de teratomas de hPSCs utilizando a cápsula testículo como o local para o crescimento do tumor.
O método aqui apresentado fornece um altamente confiáveis, simples meios de geração de teratomas de hPSCs na cápsula testicular. Existem vários parâmetros críticos nesta técnica. Em particular, é importante para injectar linhas celulares hPSC que são conhecidos por serem pluripotentes como controlo. Outros parâmetros importantes incluem o intervalo de tempo entre a injecção ea observação do tumor. Para linhas de células como WA09, teratomas deve ser observado em 6-8 semanas. Para novas linhas de IPSC, descobrimos que muitas vezes são necessárias 10 semanas. Outra preocupação é o número de células injectadas. Nós injetar um milhão de células, mas o teste pode ser feito facilmente com poucas células. Além disso, o meio de injecção é importante. Nós descobrimos que os melhores resultados quando as células são injectadas numa mistura 1:1 de matrigel e DMEM/F-12, em oposição a PBS ou DMEM/F-12.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por doações CIRM # TR-1250, RT1-01108, e CL1-00502.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Accutase | Invitrogen | A1110501 |
DMEM/F-12 | Invitrogen | 113300-032 |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 |