نحن تصف عزلة العضلية الولدان وإعداد الخلايا للتغليف في بنيات هيدروجيل الليفين للهندسة الأنسجة. نحن تصف طرق لتحليل الأنسجة المهندسة عضلة القلب بعد فترة الثقافة بما في ذلك إنشاء قوة فاعلة على التحفيز الكهربائي وبقاء الخلية ، وتلطيخ immunohistological.
زراعة الخلايا في بيئة ثلاثية الأبعاد هيدروجيل هي تقنية هامة لتطوير بنيات للهندسة الأنسجة ، وكذلك دراسة الاستجابات الخلوية في ظل ظروف مختلفة الثقافة في المختبر. بيئة ثلاثية الأبعاد بشكل وثيق ما يحاكي مراقبة الخلايا في الجسم الحي نتيجة لتطبيق من المحفزات الميكانيكية والكيميائية في جميع أبعاد 1. يمكن إما ثلاثي الأبعاد الهلاميات المائية أن تكون مصنوعة من البوليمرات الاصطناعية مثل PEG – DA 2 و 3 PLGA أو عدد من البروتينات التي تحدث بشكل طبيعي مثل الكولاجين 4 ، 5 أو حمض الهيالورونيك الليفين 6،7. يمكن الهلاميات المائية التي تم إنشاؤها من الليفين ، وهو بروتين في الدم طبيعيا تخثر الدم ، تتبلمر لتشكيل شبكة الذي هو جزء من شفاء الجروح في الجسم الطبيعية العمليات 8. الليفين هو خلية للتحلل ذاتي ويحتمل 9 ، مما يجعلها مثالية سقالة مؤقتة للهندسة الأنسجة.
نحن هنا تصف بالتفصيل عزلة العضلية الولدان من الصغار لمدة ثلاثة أيام الجرذ القديمة وإعداد الخلايا للتغليف في بنيات هيدروجيل الليفين للهندسة الأنسجة. myocytes حديثي الولادة هي مصدر الخلايا الشائعة المستخدمة في الدراسات المختبرية لفي تكوين أنسجة القلب والهندسة 4. يتم إنشاء الليفين هلام بواسطة الفيبرينوجين الاختلاط مع ثرومبين الانزيم. ثرومبين يشق fibrinopeptides فرانس برس وFPB من الفيبرينوجين ، وكشف عن مواقع الربط التي تتفاعل مع غيرها من مونومرات 10. هذه التفاعلات تؤدي إلى أحادية في الألياف التي تشكل شبكة هيدروجيل الذاتي التجمع. لأنه لا يمكن ضبط توقيت هذا التفاعل الأنزيمي عن طريق تغيير نسبة ثرومبين إلى الفيبرينوجين ، أو نسبة الكالسيوم إلى ثرومبين ، يمكن للمرء أن يبني حقن القالب مع عدد من الأشكال الهندسية المختلفة 11،12. فإننا قادرون على توليد مزيد من التوافق بين أنسجة الناجم عن الكيفية التي تحد من خلال ثقافة هلام 13.
بعد زراعة الأنسجة والهندسة يبني القلب لمدة أسبوعين في ظل ظروف ثابتة ، بدأت خلايا القلب لاعادة تشكيل وبناء ويمكن أن تولد قوة الانكماش في ظل ظروف سرعة الكهربائية 6. كجزء من هذا البروتوكول ، ونحن أيضا وصف أساليب لتحليل الأنسجة المهندسة عضلة القلب بعد فترة الثقافة بما في ذلك التحليل الوظيفي للقوة النشطة الناتجة عن عضلة القلب بناء على التحفيز الكهربائي ، فضلا عن أساليب لتحديد الجدوى النهائية الخلية (مباشر الميت مقايسة) ، وتلطيخ immunohistological لدراسة مورفولوجية والتعبير النموذجي البروتينات هامة للانكماش (الميوسين السلسلة الثقيلة أو MHC) واقتران الخلوية (43 أو Connexin Cx43) بين myocytes.
لتغليف الخلايا العضلية الفئران حديثي الولادة في نتائج المواد الهلامية الليفين في ثلاثية الأبعاد ثابتة وقابلة للحياة في المختبر نموذج لنظام عضلة القلب. الليفين هو مادة بيولوجية المفضل لأنه عندما يتم شرك الخلايا ، فهي تنشط عملية الأيض وقادرة على ضغط ، إعادة عرض وإعادة مصفوفة خارج الخلية التي تنسجم مع أنسجة القلب الأصلي 12. لأن نسمح العضلية لصوتها في هذه البيئة ، وظائفها هو أكثر سمة من عضلة القلب مما يؤدي إلى انكماش قوة أكبر بالمقارنة مع الأنسجة الخواص 6. لتطبيقات علاجية محتملة ، فمن الضروري لتغليف الخلايا ضمن المواد التي تشجع كل من سلامة وظيفة. قدم هنا شرح البروتوكولات وسيلة فعالة ودقيقة لإنشاء شبكة لمراقبة القلب الليفين السلوك خلية في المكروية ثلاثية الأبعاد.
قد تنشأ بعض القضايا المحتملة خلال خلق ثقافة وهذه التركيبات. قضية واحدة محتملة هي صون سلامة الخلية قبل التغليف ، والتي سوف تؤثر تأثيرا كبيرا على وظيفة بناء. وينبغي بذل جهود للحد من موت الخلية بعد العزلة من خلال تقليل الفترة الزمنية الفاصلة بين العزلة والتغليف للخلايا داخل الجل الليفين. وينبغي توفير بنيات وسائل الاعلام كل يوم على جدول زمني صارم. بالإضافة إلى ذلك ، فمن المهم لضمان التجانس في كافة الحلول المستخدمة. إذا كان خليط من الفيبرينوجين ، وخلايا تنتج ثرومبين بيئة غير متجانسة ، وقدرة الخلايا لاعادة تشكيل ECM ، هو عرقلة محتملة زوجين ميكانيكيا والعقد. من المهم أيضا للحيلولة دون تشكيل فقاعات الهواء خلال حقن يبني من أجل منع حصول أعمال شغب في استمرارية النسيج هندسيا. طريقة واحدة للتخفيف من حدة هذه المشكلة هو جذب المزيد من هلام أكثر مما هو مطلوب لجعل بناء في المحاقن وحقن ببطء. أخيرا ، وبمجرد أن وضعت مصفوفة الليفين وكان في مستنبت لمدة 24 ساعة ، فمن الضروري فصل بناء من الجانبين من العفن الدائري لتعزيز الضغط على الخلية من هلام الليفين. الحفاظ على بناء في وسط القالب يسهل تبادل الغاز والمواد الغذائية. قد الانضمام الى جانبي القالب الدائري يعطل أيضا المحاذاة المطلوب الخلوية.
ومن المهم أن نلاحظ أن يستخدم قطع الرأس واعية كأسلوب من euthanization في هذا البروتوكول ، الذي هو وسيلة مقبولة في إطار المبادئ التوجيهية من كل من المعاهد الوطنية للصحة والجمعية الطبية الأمريكية للطب البيطري. ومع ذلك ، فإن بعض المؤسسات يوصي استخدام مخدر تليها قطع الرأس للفئران حديثة الولادة. اخترنا قطع الرأس واعية لأنه يضمن الحد الأدنى من الوقت في ظل ظروف نقص الأوكسجين للأنسجة القلب رفعه / الخلايا. يمكن أن كميات صغيرة نسبيا من نقص الأكسجين يؤدي إلى نقص التروية العضلية والموت المحتمل العضلية ، والتي يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على نتائج هذا البروتوكول.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة — القومي للقلب والرئة والدم المعهد (جائزة # R00HL093358 لLDB).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Sodium chloride | Sigma | S7653 | PBS |
Potassium chloride | Sigma | P9333 | PBS |
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S7907 | PBS |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS |
Glucose | Sigma | G5400 | Isolation |
hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | Isolation |
fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | Isolation |
large scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | Isolation |
micro-scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | Isolation |
scalpel handle | Fine Science Tools | 10008-13 | Isolation |
scalpel blade | Fisher Scientific | 08-918-5A | Isolation |
Absorbent bench underpad | VWR | 56617-014 | Isolation |
sterile drape | Fisher Scientific | GM42526 | Isolation |
autoclave bag | Fisher | 01-812-54 | Isolation |
gauze pad | Fisher Scientific | 13-761-52 | Isolation |
betadine | Purdue Products | 67618-150-01 | Isolation |
sterile gloves | Fisher Scientific | 19-020 | Isolation |
sterile transfer pipette | Fisher Scientific | 9962 | Isolation |
collagenase | Worthington | CLS2 | Isolation |
Teflon rod 1/4 inch diameter | McMaster-Carr | 8546K11 | Mold part |
Teflon tube 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 8547K31 | Mold part |
Silicone O-Ring 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 9396K204 | Mold part |
Teflon tube 1/4 inch ID, 5/16 inch OD | McMaster-Carr | 52355K14 | Mold part |
Kendall monoject syringes 6cc | Fisher Scientific | 05-561-41 | Mold part |
BD syringe 3cc | Fisher Scientific | 309585 | Mold part |
Bovine Fibrinogen | Sigma | F8630 | Construct |
Bovine Thrombin | Sigma | T7513 | Construct |
1 M HEPES | Sigma | H0887 | Construct |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | Construct |
DMEM | Invitrogen | 10569 | Construct |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Construct |
Calcium Chloride | Sigma | 383147 | Construct |
0.2 micron filter | Fisher Scientific | SCGVT05RE | Construct |
40 micron cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Construct |
0.45 micron bottle top filter | Corning | 430627 | Construct |
glass pre-filter | Millipore | AP2007500 | Construct |
18G 1 1/2 inch long needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Construct |
21G 1 inch needle | Fisher Scientific | 14-826C | Construct |
construct jars | Fisher Scientific | 2116 | Construct |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | Media |
horse serum | Sigma | H1138 | Media |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000 | Media |
aminocaproic acid | Acros Organics | 103305000 | Media |
ascorbic acid | Sigma | A5960 | Media |
insulin | Sigma | I9278 | Media |
Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Histology |
Optimal cutting temperature (OCT) | Ted Pella | 27050 | Histology |
2-methylbutane | Fisher | 03551-4 | Histology |
Mouse MYH1/2/4/6 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-32732 | Histology |
Rabbit Connexin 43 primary antibody | Cell Signaling Technology | 3512 | Histology |
Dylight 549-conjugated donkey anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-505-151 | Histology |
Dylight 488-conjugated Donke anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-485-152 | Histology |
Live/dead assay | Invitrogen | L-3224 | Analysis |