Nous avons établi un protocole pour l'induction de cardioblasts direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs cardiaques humaines et fonctionnel pour les cardiomyocytes cardiovasculaires réparation.
À ce jour, l'absence d'une source appropriée de cellules humaines cardiaques a été le revers majeur dans la régénération du myocarde humain, soit par transplantation de cellules à base cardiaques ou par génie tissulaire 1-3. Cardiomyocytes deviennent terminale différenciée peu après la naissance et perdent leur capacité à proliférer. Il n'existe aucune preuve que les cellules souches / progénitrices provenant d'autres sources, telles que la moelle osseuse ou le sang du cordon, sont capables de donner naissance à des cellules contractiles du muscle cardiaque après transplantation dans le coeur 1-3. Le besoin de se régénérer ou de réparer le muscle cardiaque endommagé n'a pas été atteint par une thérapie de cellules souches adultes, soit endogène ou via la livraison de cellules 1-3. Le maïs génétiquement stables cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont une capacité d'expansion illimitée et la plasticité illimitée, proférer un réservoir pluripotentes dans la dérivation in vitro de l'approvisionnement important de cellules somatiques humaines qui sont limitées à la lignée qui en ont besoinde réparation et de régénération 4,5. En raison de la prévalence des maladies cardiovasculaires dans le monde entier et aiguë la pénurie de donneurs d'organes, il ya un vif intérêt dans les thérapies à base de CSEh en développement comme une approche alternative. Cependant, comment canaliser le potentiel de différenciation des CSEh gamme pluripotentes efficacement et de façon prévisible à un phénotype désiré a été un défi majeur pour les deux étude sur le développement et la traduction clinique. Les approches classiques s'appuient sur la multi-lignée de cellules pluripotentes inclinaison grâce à la différenciation de germe de la couche spontanée, résultant dans la lignée de l'engagement-inefficace et incontrôlable qui est souvent suivie d'hétérogénéité phénotypique et de l'instabilité, par conséquent, un risque élevé de tumorigénicité 6-8 (voir un schéma de Fig. 1A). En outre, les étrangers non définie / animal suppléments biologiques et / ou des mangeoires qui ont généralement été utilisé pour l'isolation, l'expansion et la différenciation des CSEh peuvent faire usage direct de ces cellules-spécialisationzed greffes chez des patients problématiques 9-11. Pour surmonter ces obstacles, nous avons résolu les éléments d'un système de culture définies nécessaire et suffisante pour le maintien de la pluripotence des CSEh épiblaste, servant de plateforme de novo dérivation de CSEh cliniquement appropriée et efficace de diriger les CSEh uniforme de telles lignées envers cliniquement pertinentes par de petites molécules 12 (voir le schéma dans la Fig. 1B). Après criblage d'une variété de petites molécules et des facteurs de croissance, nous avons constaté que ces conditions définies rendu nicotinamide (NAM) suffisante pour induire la spécification de cardiomesoderm direct de CSEh pluripotentes encore progressé au cardioblasts qui a généré des cardiomyocytes humains battre avec une grande efficacité (Fig. 2 ). Nous avons défini les conditions d'induction de cardioblasts direct de CSEh pluripotentes sans intervention multi-lignée stade de corps embryoïdes, permettant bien contrôlée de dérivation efficace d'ungrande quantité de cellules cardiaques humaines à travers le spectre des stades de développement à base de cellules thérapeutiques.
Un des défis majeurs pour les deux étude sur le développement et la traduction clinique a été la manière de canaliser le potentiel de différenciation éventail de cellules souches humaines pluripotentes à un phénotype désiré de manière efficace et prévisible. Bien que ces cellules peuvent se différencier spontanément in vitro en cellules de toutes les couches de germe en passant par une phase globale multi-lignée, dans les CSEh dérivées de lignées multiples agrégats (corps embryoïdes), seule une très petite fraction des cellules (<2%) spontanément se différencier en cardiomyocytes 13-15 (fig. 1A). Immunosélection Après, les populations enrichies de cardiomyocytes ont été en mesure de fonctionner comme les stimulateurs cardiaques biologiques pour sauver la fonction d'un myocarde lésé mécaniquement et électroniquement suite à l'injection dans le coeur de modèles animaux 13. Dans des modèles de rongeurs infarci, greffées sur les CSEh dérivées descendances cardiaques ont été capables de survivre et de mûrir jusqu'à 12 semaines, et partiellement remuscularIze le cœur blessé et améliorer la fonction contractile 14,15. Toutefois, l'inefficacité dans la génération humaine cardiaque commis par le biais des cellules de lignées multiples différenciation des cellules pluripotentes et le risque élevé de la transplantation tumorigénicité suivantes ont entravé autre traduction clinique. Développer des stratégies pour canaliser le potentiel de différenciation des CSEh gamme pluripotentes exclusivement et de façon prévisible à un phénotype cardiaque est essentielle pour exploiter la puissance de la biologie des CSEh dans le domaine cardiaque. Afin d'atteindre uniformément conversion des cellules souches pluripotentes humaines d'une lignée particulière, nous avons employé un système de culture définies capable d'assurer la prolifération des CSEh indifférenciées d'identifier les conditions pour bien contrôlée par induction efficace de CSEh pluripotentes exclusivement à une lignée particulière cliniquement pertinentes par simple mise à disposition de petites molécules (Fig 1B). Nous avons constaté que la nicotinamide cardiaque induite par l'engagement de lignée directe de pCSEh luripotent sous culture définies qui encore progressé à battre cardiomyocytes avec une grande efficacité (Fig. 2). Nkx2.5 est un facteur de transcription à homéoboîte évolutionnaires conservé indispensable pour le développement cardiaque normal et les mutations du gène sont associées à des maladies cardiaques humaines congénitale (CHD), l'anomalie congénitale la plus fréquente de l'homme 16. Expression de Nkx2.5 est la première marqueur de cellules précurseurs cardiaques chez tous les vertébrés examinés jusqu'ici et est essentielle pour cloisonnement cardiaque adéquate et la formation / maturation du système de conduction électrique 16. Chez les vertébrés, l'apparition et la tendance du début de l'expression Nkx2.5 environ coïncider avec le calendrier et la superficie de la spécification cardiaque dans l'embryogenèse précoce, et Nkx2.5 gène continue à être exprimée à travers le développement dans le coeur 16. Dans notre modèle de CSEh, NAM apparu pour déclencher l'induction cardiaque directe de CSEh pluripotentes en favorisant l'expression de la cardiaques spécifiques transcriNkx2.5 facteur ption dans un processus qui pourrait émuler les spécifications de cardiomesoderm de l'épiblaste pluripotentes dans cardiogenèse embryonnaires humaines. Des études futures révèlent molécules contrôle génétique et épigénétique dans le développement du cœur humain comme des alternatives, qui peuvent ouvrir la voie à de petites molécules à médiation contrôle direct et la modulation du destin pluripotentes CSEh lors de la dérivation des lignées cliniquement pertinentes pour les thérapies régénératrices. Sans traitement NAM, CSEh <2% va subir différenciation spontanée en battant les cardiomyocytes 12-15. Avec un traitement NAM, nous avons été en mesure de générer> 95% d'embryons précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes bat> 50% de CSEh maintenu sous une culture de définir dans un processus qui pourrait émuler le développement humain coeur embryonnaire 12. Récemment, connue cardiaque gènes déterminant le destin ont été utilisés pour transdifférencier fibroblastes de souris en post-natal cardiomyocytes battre avec un faible rendement de <0,5% 17, 18 </ Sup>. Toutefois, reprogrammées cellules somatiques ont été historiquement associée à l'expression des gènes anormaux et de la sénescence accélérée avec une utilité thérapeutique déficience 19-21. Enfin, le protocole, nous avons établi ici est limitée à CSEh pluripotentes dérivées de la masse cellulaire interne (MCI) ou épiblaste du blastocyste humain 4,5, peut ne pas s'appliquer à d'autres cellules pluripotentes, y compris les animaux provenaient des CES, les CES issus de morula tôt (huit cellules) au stade 22 embryons et les cellules reprogrammées artificiellement 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP a été soutenue par le National Institute of Health (NIH) des subventions de l'Institut national sur le vieillissement (NIHK01AG024496) et The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health et le développement humain (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |