揭示多色标记中的神经环路拓扑结构

摘要

我们提供了一种示踪剂递送的实用指南 体内 并以脊髓小脑通路为模型系统，演示在小鼠中成功进行神经环路分析的关键步骤。我们详细描述了一种灵活的示踪方案，该方案利用与Alexa荧光染料偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）。

摘要

神经回路被组织成功能性的拓扑图谱。为了可视化复杂的回路结构，我们开发了一种可可靠地标记多种拓扑投射全局模式的方法。小脑是研究神经回路有序排列的理想模型。例如，脊髓小脑苔藓纤维的区室化组织已被证明是研究苔藓纤维投射模式不可或缺的系统。我们最近发现，与Alexa 555和488偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）可用于示踪发育期和成年小鼠中的脊髓小脑苔藓纤维投射（Reeber等，2011年）。我们发现WGA-Alexa示踪剂具有三个重要特性，使其成为标记神经投射的理想工具。第一，Alexa荧光染料亮度高，强度大，可在示踪后直接进行整体成像。第二，WGA-Alexa示踪剂能够标记发育期和成年神经投射的完整路径。第三，WGA-Alexa示踪剂可在顺行和逆行方向上快速运输。本文中，我们将详细描述如何制备示踪剂及其他所需工具、如何进行脊髓小脑示踪手术，以及如何最佳地对示踪后的投射进行三维成像。总之，我们提供了一套逐步操作的示踪方案，不仅有助于解析小脑中功能图谱的组织与连接性，也适用于大脑皮层、脑干和脊髓的功能图谱研究。

方案

1. 示踪剂的递送 体内 采用无菌手术（第1.1–1.16节）

在整个操作过程中，建议采用标准的无菌外科技术。这包括使用无菌手套、手术衣和面罩。器械应在使用前进行高压灭菌，或先用清水彻底清洗，再用乙醇消毒。在手术过程中，尤其是在每只动物之间，应清除器械上的组织碎片，并使用热珠灭菌器对器械进行干热灭菌（Steri 250 货号 # 18000-45，Fine Science Tools）。此外，必须合理组织工作区域，设置专门用于动物准备（如剃毛等）、手术操作以及术后恢复的区域，以便于监测动物状态、提供保温措施并根据需要给予镇痛药物。成功开展可存活手术的关键在于降低感染风险，并实施积极的术后护理策略。有关本实验方案所需全部设备和试剂的详细信息，请参见下表。

1. 通过腹腔注射（i.p.）给予新鲜配制的 Avertin（2,2,2-三溴乙醇，Sigma，St. Louis MO；货号 # T48402）以麻醉成年小鼠，剂量为每10克体重0.2 ml。其他麻醉剂如异氟烷或氯胺酮/甲苯噻嗪同样有效，但在使用前请确保您的实验室已获得必要的机构和联邦批准。若使用幼鼠（P0–P10），可将其置于碎冰上麻醉10–15分钟。确保每只幼鼠的皮肤不直接接触冰块（例如，可将其置于乳胶手套的指端内），因为冷水会迅速导致致命性低体温。通过用镊子或手指夹捏动物后肢脚趾进行痛觉反射测试，确认动物已达到可接受的麻醉深度。若存在屈肌反射，需继续等待直至动物对该刺激无反应，表....

讨论

我们介绍了利用一种新型荧光标记方法，在发育期和成年小鼠中成功进行轴突和树突示踪所需的手术与技术细节。通过使用WGA-Alexa，我们展示了如何利用示踪剂和标记物以高分辨率和三维方式分析神经环路的投射图谱。

目前有多种示踪剂可用于神经环路的示踪，包括霍乱毒素亚单位B（Cholera toxin subunit B）、生物胞素（Biocytin）、神经生物素（Neurobiotin）、菜豆凝集素（Phaseolus vulgaris leucoagglutinin, PHAL）、荧光金（fluororuby）、荧光翠绿（fluoremerald）和荧光金（fluorogold）。此外，近年来基于遗传学和病毒的示踪技术表明，分子特征 distinct 的神经元亚群能够以高度精确的方式在拓扑结构上与其靶区相连。需要注意的是，尽管某些神经示踪剂主要沿顺行或逆行方向运输（例如分子量为10,000的BDA与分子量为3,000的BDA），但示踪分子通常在两个方向上均有运输。在我们的研究中，我们引入了WGA-Alexa系列示踪剂，作为分析拓扑投射模式的可靠神经解剖学工具。我们证明，WGA-Alex.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微珠灭菌器	Fine Science Tools	型号 Steri 250 货号 # 18000-45
电灼器	Fine Science Tools	货号 # 18000-00
硼硅酸盐玻璃毛细管	Harvard Apparatus	货号 # 300056
双级玻璃微量移液器拉制仪	Narishige International	型号 001-PC-10
微量注射器	Gilmont Instruments	货号 # GS-1100
小型动物立体定位仪	Kopf Instruments	型号 940-A
电极操纵器	Kopf Instruments	型号 960
兽用护理舱	Harvard Apparatus	货号 # 340508
加热垫	Harvard Apparatus	货号 # 341241
Leica DFC360 FX 相机	Leica Microsystems	DFC360 FX
Leica DFC490 相机	Leica Microsystems	DFC490
Leica DM5500 显微镜	Leica Microsystems	DM5500
Leica DFC3000 FX 相机	Leica Microsystems	DFC3000 FX
Leica MZ16 FA 显微镜	Leica Microsystems	MZ16 FA
CY3 滤光片	Leica Microsystems	型号 # 11600231
FITC 滤光片	Leica Microsystems	型号 # 11513880
A4 DAPI/UV 滤光片	Leica Microsystems	型号 # 11504162
麦芽凝集素，Alexa Fluor 488 标记	Invitrogen	货号 #W11261
麦芽凝集素，Alexa Fluor 555 标记	Invitrogen	货号 #W32464