使用恒定力轴向光镊拉伸短DNA序列

摘要

我们展示了使用恒力轴向光镊来研究短DNA分子的力学特性。通过轴向拉伸DNA，我们最大限度地减少了传统侧向操作中产生的空间位阻和人为假象，从而能够研究长度短至约100 nm的DNA分子。

摘要

对于拉伸轮廓长度小于一千碱基对的DNA，单分子技术存在诸多实验困难。然而，许多重要的生物学事件（如组蛋白结合以及蛋白质介导的DNA成环^1,2）正是发生在此长度尺度上。近年来研究表明，DNA的力学特性在DNA压缩包装形成核小体和染色质纤维等基本细胞过程中起着重要作用^3,4。因此，深入理解短片段DNA的力学性质显得尤为重要。本文中，我们提供了一种实用的单分子光镊技术操作指南，该技术由我们实验室开发，可用于研究轮廓长度短至数百个碱基对的DNA的力学行为。

拉伸短片段DNA的主要难点在于，传统的光镊通常被设计为在垂直于载物台的方向上施加力^5,6, （见图1）。在此几何构型中，当DNA长度为亚微米级时，微珠与DNA锚定的盖玻片之间的夹角变得非常陡峭。此时必须考虑轴向位置的影响，这可能带来技术上的挑战；并且由于延伸会使微球更靠近盖玻片，空间位阻效应随之增强。此外，由于微球具有不对称性，在光镊中微球旋转时，侧向延伸会在延伸过程中因反作用力方向的改变而产生不同程度的扭矩。

用于拉伸亚微米级DNA的替代方法面临着各自独特的障碍。例如，双光束光镊仅能拉伸长度接近光波波长的DNA，此时两个光镊之间以及微球间光散射引起的干涉效应会带来显著问题。若将其中一个光镊替换为微移液管，很可能也会遇到类似的挑战。虽然可以直接利用轴向势阱来拉伸DNA，但需要采用主动反馈系统以施加恒定的力，而该系统的带宽将非常有限，尤其是在低力条件下。

我们通过使用恒力轴向光镊直接将DNA从盖玻片表面拉开，从而规避了这些基本问题^7,8。该方法通过将微球捕获在光势场的线性区域实现，在此区域内光力保持恒定，其大小可通过调节激光功率进行调控。将微球限制在线性区域内，还可作为对DNA的全光学力钳，其在轴向上可延伸近350 nm。同时，我们通过精细调节载物台的位置，补偿热漂移和机械漂移，使粘附在盖玻片上的参考微球始终保持在同一位置和焦平面上，从而实现近乎无限长的观察时间。

方案

1. 镊子装置设置

1. 来自1064 nm激光的光束被分成两束正交偏振的光束。其中一束用于操控生物分子，另一束用于校准（见图2）。
2. 操控光束的强度由声光偏转器（AOD）控制，而每束光的位置和焦点则分别由光束转向镜和光学望远镜独立控制。
3. 随后，两束光通过另一个偏振分束器重新合并，并经由最后一组伸缩式光学元件进行调节，使其略微超过显微物镜后孔径的填充。校准光束采用50%的过填充可形成紧密的光镊，而操控光束则使用稍小的填充因子（约20%），从而获得较浅的焦点，转化为线性势场中更大的可操作区域。光束由一个PlanApo 60x/1.4油浸显微物镜紧密聚焦到样品池上。
4. 该光镊系统结合了一个自行搭建的明场显微镜，后者通过聚光镜将卤素灯的照明聚焦到样品室。明场图像由二向色镜与激光光分离，随后成像于两个CCD相机上。其中一个CCD作为主要数据采集手段，可通过软件触发以实现精确的采样率；另一个CCD用于成像一个固定参考微球，其位置作为反馈控制系统，用于补偿显微镜的漂移。
5. 样品通过XY平台进行粗略定位，随后可通过内置的三维压电平台实现精确位置调节。
6. 前向散射和透射的激光由明场聚光镜收集，并聚焦到光电探测器上。所得信号经100 kHz的抗混叠滤波器滤波后，放大并通过DAQ卡以200 kHz的频率进行采集。

2. 将微珠表观尺寸校准至轴向位置

1. ....

讨论

传统的光镊依赖模拟或计算机控制的反馈系统，以对折射性物体施加恒定的力。这些主动反馈系统在样品发生突然伸展变化的情况下难以正常工作，例如蛋白质结合到DNA上，或分子马达沿纤维快速步进时。近年来已开发出多种施加恒定力的被动方法。其中一种方法用于实现RNA聚合酶在碱基对分辨率下的步进解析，该方法基于高斯激光束光学势的线性区域进行操作¹²。我们已将该方法改进，用于短生物分子的操作，构建了恒力轴向光镊系统。

轴向光镊可用于研究传统光学方法难以操控的短片段DNA。该技术已被用于研究长度仅数百个碱基对的短DNA分子的弹性⁸，并探测弹性张力对蛋白质介导的DNA成环过程的影响^13,14。在较短的尺度上，由氢键和堆叠能差异引起的序列依赖性效应可能显著影响DNA的弹性特性。轴向光镊是揭示这些序列依赖性对DNA弹性影响的理想工具¹⁵。此外，轴向光镊还将成为研究DNA在单个组蛋白周围缠绕行为的灵敏工具，并可用于探测任何快速行进的分子马达的活性，有望成为单分子研究工具箱中一种有价值的新型技术。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/设备	公司	货号	评论
Nd:YVO4 激光器	Spectra Physics	T40-Z-106C
声光偏转器	IntraAction	DTD-274HA6
显微镜物镜	Olympus	PlanApo	60X，数值孔径 1.4
压电平台	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ 轴平台
CCD相机	PixeLink	PL-A741
光电探测器	电光技术	ET-3020
聚苯乙烯微球	Spherotech	SVP-08-10	800 nm，链霉亲和素包被
抗地高辛	罗氏	11333089001	来自绵羊
引物	MWG操纵子	定制寡核苷酸	一条引物：生物素，另一条：地高辛
PCR试剂	New England Biolabs	TAQ 聚合酶，dNTPs
盖玻片	Fisher Scientific
缓冲液用其他化学品	Fisher Scientific
补充材料
A. 流体动力摩擦系数–高效
用于测定流体动力学摩擦系数 c–微球在表面附近的系数可采用以下展开式5,10:
其中引入了以下简写形式：
摩擦系数–效率根据流体黏度定义 η 以及微球的半径，微球中心位于某一距离处 η 表面之上。当展开至约十项时，该级数和收敛性良好。
B. 轴向位置对刚度标定的影响
捕获阱刚度的校准需在标定精度与捕获阱实际使用的轴向位置之间进行权衡。标定精度随距表面距离的增加而提高，因此通常在距表面约800-1000 nm处进行校准，该位置高于实际实验条件下的使用位置。
C. 修正的蠕虫状链（WLC）模型
力-延伸曲线可拟合到一个修正的WLC模型，该模型考虑了在零光力条件下的体积排斥效应，具体如下：
其中 Fopt 是光力， xo 是一个用于零力伸长的拟合参数，xopt 是在受力下的延伸， l 是DNA的轮廓长度，以及l*p 是用于拟合的第二个参数 "有效" 持久长度 Fwlc 由通常的WLC模型给出11 其中 ε 是DNA的相对延伸率。