تقييم Hypermutation الجسدية في خلايا B راموس بعد Overexpression أو ضربة قاضية لجينات معينة
Summary
نحن تصف كيفية تنفيذ فيروسات أو التهابات lentiviral من overexpression shRNA أو المحتوية. يبني الإنسان راموس في الخلية B الخط وكيفية قياس جسدية hypermutation في هذه الخلايا
Abstract
خلايا B تبدأ حياتها مع الأجسام المضادة الناتجة عن انخفاض تقارب تأشب الخامس J (D). ومع ذلك ، بناء على الكشف عن العوامل المسببة للأمراض ، وتحور المتغير (V) المنطقة من الجين (IG) الغلوبولين المناعي ما يقرب من 100،000 مرات أكثر من بقية الجينوم خلال hypermutation جسدية (SHM) ، مما أدى إلى ارتفاع تقارب 1،2 الأضداد. بالإضافة إلى ذلك ، فئة التوحد التبديل (CSR) وتنتج الأجسام المضادة مع وظائف المستجيب مختلفة تبعا لنوع من رد الفعل المناعي ان هناك حاجة لعامل ممرض معين. وبدأ كل من المسؤولية الاجتماعية للشركات والتي SHM نازعة أمين سيتيدين التنشيط التي يسببها (AID) ، والتي deaminates مخلفات السيتوزين في الحمض النووي لانتاج uracils. تتم معالجة هذه uracils بأشكال عرضة للخطأ من مسارات الإصلاح ، مما يؤدي في النهاية إلى حدوث طفرات وإعادة التركيب 1-3.
فهمنا الحالي للتفاصيل الجزيئي للSHM والمسؤولية الاجتماعية للشركات تأتي من مجموعة من الدراسات التي أجريت في الفئران وخلايا الأولية ، وخطوط الخلية ، والخلية F -ري التجارب. نماذج الماوس تبقى المعيار الذهبي مع بالضربة القاضية الجينية تظهر أدوارا حاسمة لعوامل كثيرة إصلاح (على سبيل المثال اونغ ، MSH2 ، Msh6 ، Exo1 وبوليميريز η) 40-10. ومع ذلك ، ليس كل الجينات قابلة للدراسات خروج المغلوب. على سبيل المثال ، بالضربة القاضية من عدة مزدوج الجديلة البروتينات إصلاح كسر مميتة بشكل أولي أو يضعف B – الخلية التنمية 11-14. وعلاوة على ذلك ، قد تكون في بعض الأحيان ملثمين وظيفة معينة من البروتين في SHM أو المسؤولية الاجتماعية للشركات عن عيوب أكثر عالمية بسبب خروج المغلوب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن منذ التجارب على الفئران أن تكون طويلة ، وتغيير تعبير الجينات الفردية في خطوط الخلايا قد تصبح خطوة شعبية متزايدة الأولى لتحديد وتوصيف الجينات مرشح 15-18.
وقد تم شعبية الخلية سطر نموذج لدراسة SHM 18-24 — راموس — خلية سرطان الغدد الليمفاوية بيركيت الخط الذي يمر constitutively SHM. ميزة واحدة من الخلايا راموس هو أن لديهم المدمج في شبه مريحةقياس كمي للSHM. خلايا التعبير عن نوع IgM و البرية ، لأنها تلتقط الطفرات ، وبعض من الطفرات ضرب التعبير الغلوبولين المناعي. لذلك ، يعاير خسارة الغلوبولين المناعي عن طريق المسح الضوئي مضان تنشيط الخلايا (FACS) يوفر قراءة سريعة التدريجي لمستوى SHM. ويمكن الحصول على مزيد من القياس الكمي للSHM بواسطة تسلسل الجينات مباشرة الأضداد.
منذ الخلايا راموس يصعب transfect ، ونحن ننتج المشتقات المستقرة التي زادت أو خفضت التعبير عن الجينات الفردية التي تصيب الخلايا مع فيروسات أو يبني lentiviral التي تحتوي إما على كاسيت أو overexpression قصيرة الحمض النووي الريبي القاسي (shRNA) ، على التوالي. هنا ، نحن تصف كيف تصيب الخلايا راموس ومن ثم استخدام هذه الخلايا لبحث دور للجينات محددة بشأن SHM (الشكل 1).
Protocol
Discussion
كما نوقش سابقا ، وأصبحت نماذج خط الخلية لتنويع الضد نقطة انطلاق لتحديد شعبية رواية البروتينات التي تؤثر على خطوات مختلفة خلال تنويع الأضداد. نقدم هنا طريقة لاستخدام عدوى فيروسية للبروتينات إما إلى أسفل ، أو تدق overexpress في خط B – الخلية راموس ومن ثم دراسة تأثير ذلك على SHM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وpMSCV – AID – I – Thy1.1 pKat2 وناقلات وهدية عينية من المديرية العامة للكاتس وpVSV – G ، pRSV رؤيا ، وpMDLg / pRRE ناقلات كانت هدية من نوع كولين BR.
Materials
Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Medical | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Life Sciences | 4604 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder | Difco | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio-Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
References
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt’s lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
