13 C-marquage isotopique est une technique utile pour déterminer le métabolisme de la cellule centrale pour divers types de microorganismes. Après les cellules ont été cultivées sur un substrat spécifique marqué, GC-MS de mesure peut révéler des voies métaboliques fonctionnelles basées sur les modèles d'étiquetage unique dans protéinogènes acides aminés.
Les microbes ont des voies métaboliques complexes qui peuvent être étudiés en utilisant des méthodes de biochimie et fonctionnelles en génomique. Une technique important d'examiner le métabolisme des cellules centrales et de découvrir de nouvelles enzymes est de 13 C-analyse assistée par le métabolisme 1. Cette technique est basée sur le marquage isotopique, par lequel les microbes sont nourris avec un substrats C 13 étiquetés. En retraçant les chemins de transition entre les atomes de métabolites dans le réseau biochimique, nous pouvons déterminer les voies fonctionnelles et découvrir de nouvelles enzymes.
Comme une méthode complémentaire à la transcriptomique et la protéomique, les approches de isotopomère analyse assistée par des voies métaboliques contiennent trois grandes étapes 2. Tout d'abord, nous faisons pousser des cellules avec des substrats étiquetés C 13. Dans cette étape, la composition du milieu et la sélection des substrats marqués sont deux facteurs clés. Pour éviter les bruits de mesure à partir de carbone non-étiquetées dans les suppléments nutritifs, Un milieu minimal avec une seule source de carbone est nécessaire. En outre, le choix d'un substrat marqué est basé sur l'efficacité avec laquelle il élucider la voie en cours d'analyse. Parce que de nouvelles enzymes impliquent souvent la stéréochimie réaction différente ou des produits intermédiaires, en général, substrats carbonés individuellement étiquetés sont plus informatifs pour la détection de nouvelles voies que celles marqué uniformément pour la détection de trois nouvelles voies, 4. Deuxièmement, nous analysons les modèles d'étiquetage aminés acides par GC -SM. Les acides aminés sont abondants dans les protéines et peuvent ainsi être obtenus par hydrolyse de la biomasse. Les acides aminés peuvent être dérivés par la N-(tert-butyldiméthylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) avant la séparation GC. TBDMS dérivés des acides aminés peuvent être fragmentés par MS et aboutir à des tableaux différents de fragments. Basé sur la masse à charge (m / z) Le ratio des fragmentée et non fragmentés d'acides aminés, on peut en déduire les motifs possibles de l'étiquette centrale métabolites qui sontprécurseurs des acides aminés. Troisièmement, nous traçons les transitions de carbone 13C dans les voies proposées et, sur la base de données isotopomère, confirmer si ces voies sont deux actifs. Mesure des acides aminés fournit des informations de marquage isotopique environ huit métabolites précurseur crucial dans le métabolisme central. Ces nœuds métaboliques clés peuvent refléter les fonctions des associés voies centrales.
13 Analyse du métabolisme C-assistés par l'intermédiaire protéinogènes acides aminés peuvent être largement utilisés pour la caractérisation fonctionnelle du métabolisme microbien mal caractérisé 1. Dans ce protocole, nous allons utiliser Cyanothece 51142 que la souche modèle pour démontrer l'utilisation de substrats de carbone marqué pour la découverte de nouvelles fonctions enzymatiques.
Ce protocole consiste à alimenter la cellule avec un substrat marqué et mesurer les tendances résultant de marquage isotopique dans les acides aminés via la GC-MS. Depuis de données MS (m / z ratios) donner juste la quantité globale de l'étiquetage des ions MS, nous avons à évaluer les distributions isotopomère d'acides aminés en examinant les rapports m / z de deux non fragmentés (M-57) + et fragmenté des acides aminés (ie, (M-159) + et (F302) +). Par ailleurs, nou…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été soutenue par une carrière NSF Grant (MCB0954016) et une subvention de recherche du DOE des bioénergies (DEFG0208ER64694).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | – |
THF | Sigma-Aldrich | 34865 | – |
Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | – |
GC Columns | J&W Scientific, Folsom, CA | DB5 (30m) | – |
Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | – |
Reacti-Vap Evaporator | Thermo Scientific | TS-18825 | For drying amino acid samples |