ونظام 3D لغضروفية التثقيف مفصلي الإنسان في السائل الزليلي
Summary
يوصف نظام 3D من غضروفية زراعة مفصلي الإنسان في مستويات عالية من السائل الزليلي. السائل الزليلي يعكس المكروية الطبيعية لمعظم الغضروف المفصلي ، ويمكن الحصول عليها بسهولة وتخزينها. هذا النظام بالتالي يمكن استخدامها لدراسة تجديد الغضاريف والتداوي الفرز لعلاج التهاب المفاصل.
Abstract
الغضروف التدمير هو سمة مركزية المرضية لالتهاب المفاصل ، وهو السبب الرئيسي للعجز في الولايات المتحدة. الغضروف في البالغين لا تتجدد بشكل فعال جدا في الجسم الحي ، ونتيجة لذلك ، يؤدي الى هشاشة العظام لا رجعة فيه فقدان الغضروف ويترافق الألم المزمن و1،2 الجمود. الغضروف هندسة الأنسجة إمكانات واعدة لتجديد واستعادة وظيفة الأنسجة. هذه التكنولوجيا عادة ما ينطوي على غضروفية البذر في السقالات الطبيعية أو الاصطناعية واستزراع 3D الناتجة بناء في وسط متوازن على مدى فترة من الزمن بهدف للهندسة الأنسجة كيميائيا وناضجة biomechanically التي يمكن زرعها في موقع الخلل في الجسم الحي 3-6 . تحقيق شرط الأمثل للنمو خلية غضروفية وترسب مصفوفة أمر ضروري لنجاح هندسة الأنسجة الغضروف.
في الغضروف الأصلي مشتركة ، تجويف في القطب الشماليواستحم سطح جزيئية من العظام في السائل الزليلي. هذا السائل اللزج واضحة وتوفر المواد المغذية إلى الغضروف المفصلي لاوعائي ويحتوي على عوامل النمو ، والسيتوكينات والأنزيمات التي تعتبر مهمة لعملية الأيض 7،8 خلية غضروفية. علاوة على ذلك ، السائل الزليلي يسهل حركة منخفضة الاحتكاك بين الأسطح الغضروفية أساسا من خلال إفراز عنصرين رئيسيين ، وhyaluronan lubricin 9 10. في المقابل ، غالبا ما يتم تربيتها الغضروف الأنسجة المهندسة في وسائل اصطناعية. في حين أن وسائل الإعلام هذه على الأرجح قادرة على توفير ظروف أكثر تحديدا لدراسة الأيض خلية غضروفية ، السائل الزليلي أدق تعكس البيئة الطبيعية التي تتواجد فيها غضروفية مفصلي
في الواقع ، السائل الزليلي لديها ميزة كونها سهلة للحصول على وتخزينها ، وكثيرا ما يمكن تجديدها بشكل منتظم من قبل الجسم. وقد استكملت عدة مجموعات في مستنبت مع السائل الزليلي في نمو الإنسان ، والأرانب والأبقار والكلاب جhondrocytes ، ولكنها تستخدم في الغالب سوى مستويات منخفضة من السائل الزليلي (أقل من 20 ٪) 11-25. في حين تم تربيتها الدجاج والخيول والإنسان غضروفية في المتوسط مع ارتفاع نسبة السائل الزليلي ، وكانت هذه النظم ثقافة ثنائية الأبعاد 26-28. هنا نقدم أسلوبنا في غضروفية زراعة مفصلي الإنسان في نظام 3D مع نسبة عالية من السائل الزليلي (تصل إلى 100 ٪) خلال فترة 21 يوما. في القيام بذلك ، تغلبنا على عقبة رئيسية قدمها اللزوجة العالية من السائل الزليلي. هذا النظام يتيح إمكانية دراسة غضروفية الإنسان في السائل الزليلي في وضع 3D ، والتي يمكن دمجها مع عوامل أخرى الهامتين الأخرى (توتر الأوكسجين والتحميل الميكانيكية) 29،30 التي تشكل البيئة الطبيعية لغضروف لمحاكاة الوسط الطبيعي غضروف النمو. وعلاوة على ذلك ، يمكن أيضا أن يستخدم هذا النظام لمعايرة السوائل على النشاط الزلالي غضروفية وتوفير منبر للتطويرالغضروف تجديد التقنيات والخيارات العلاجية لالتهاب المفاصل.
Protocol
Discussion
في هذا التقرير ، طورنا أسلوب الذي يسمح لثقافة غضروفية مفصلي الإنسان في بيئة 3D في المتوسط يحتوي على تركيزات عالية من السائل الزليلي الإنسان. السائل الزليلي هو واحد من العناصر الرئيسية التي تشكل البيئة الطبيعية في تجويف مشتركة ، حيث يقيم غضروفية مفصلي. ومع ذلك ، فقد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر روبن ناي (المركز الطبي لجامعة تافتس) ، ودانا اوشيمورا تومويا كيرنز (جامعة تافتس) لتقديم المساعدة في تخزين السائل الزليلي والطرد المركزي. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (1R01AR059106 – 01A1) لLZ
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | J.T. Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco-Kendall-Monoject | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco-Kendall-Monoject | 8881 | |
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Platform rocker | Thermoscientific thermolyne | Vari-mix | |
| Primers sequences | |||
| Collagen IIa-forward | 5′-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3′ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5′-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3′ | ||
| MMP13-forward | 5′-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3′ | ||
| MMP13-reverse | 5′-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3′ | ||
| Caspase 3-forward | 5′-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3′ | ||
| Caspase 3-reverse | 5′-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3′ |
References
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations–United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
- Chung, C., Burdick, J. A. Engineering cartilage tissue. Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).
- Glowacki, J. In vitro engineering of cartilage. J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).
- Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).
- Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. Cytokines in chronic inflammatory synovitis. Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).
- Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
- Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
- van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
- Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
- Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
- Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
- Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
- Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
- Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
- Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
- Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
- Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
- Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
- Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
- Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
- Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
- van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
- Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
- Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
- Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
- Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
- Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
- Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
- Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
- Anat, J. . 121, 107-118 (1976).
