Summary

Dissezione e Cultura del mouse dopaminergici e striatali Espianti di saggi di collagene matrice tridimensionale

Published: March 23, 2012
doi:

Summary

Espianti dal sistema dopaminergico mesencefalo e striato sono utilizzati in un saggio per la matrice di collagene<em> In vitro</em> L'analisi dei pathway di sviluppo mesostriatal e striatonigral. In questo saggio crescita degli assoni e la guida può essere manipolato e quantificati. Può anche essere modificato per valutare altre regioni o segnali molecolari.

Abstract

Mesencefalo dopamina (mdDA) progetto di neuroni attraverso il fascio proencefalo mediale verso diverse aree del telencefalo, compreso il corpo striato 1. Reciprocamente, i neuroni spinosi medi del corpo striato che danno luogo alla striatonigral (diretto) via innervano la substantia nigra 2. Lo sviluppo di questi tratti assoni dipende dalle azioni combinatorie di una pletora di crescita degli assoni e spunti di orientamento tra le molecole che vengono rilasciati dai neuriti (o intermedio) regioni obiettivo 3,4. Questi fattori solubili possono essere studiate in vitro da mdDA coltura e / o espianti striatali in una matrice di collagene che fornisce un substrato tridimensionale per gli assoni che mimano l'ambiente extracellulare. Inoltre, la matrice di collagene consente la formazione di gradienti relativamente stabili di proteine ​​rilasciate da espianti altri o cellule poste in prossimità (ad esempio si vedano i riferimenti 5 e 6). Qui si descrivono i metodi per i PURificazione di collagene coda di ratto, microdissezione di espianti dopaminergici e striatali, la loro cultura in gel di collagene e la successiva analisi immunoistochimica e quantitativa. In primo luogo, E14.5 il cervello di embrioni di topo sono isolate e dopaminergici e striatali espianti sono microdissezionate. Questi espianti sono poi (co) coltivati ​​in gel di collagene su vetrini coprioggetto per 48 a 72 ore in vitro. Successivamente, le proiezioni assonali sono visualizzati utilizzando marcatori neuronali (ad esempio la tirosina idrossilasi, DARPP32 o tubulina βIII) e la crescita degli assoni e le risposte degli assoni attrattiva o repulsiva vengono quantificati. Questa preparazione neuronale è uno strumento utile per studi in vitro dei meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni e mesostriatal striatonigral e guida durante lo sviluppo. Usando questo saggio, è anche possibile valutare altri (intermedio) obiettivi per assoni dopaminergici e striatali o per testare specifici segnali molecolari.

Protocol

1. Preparazione di collagene Rat Tail Raccogliere 6-10 code di ratto adulto (è possibile immagazzinare le code a -20 ° C fino al momento dell'uso). Bagnare le code in 95% etanolo notte a temperatura ambiente (RT). Dissezione di code di ratto (in cappa di coltura tissutale): (Tenere gli strumenti in etanolo al 70% quando non li utilizzano e assicurarsi che tutte le soluzioni, strumenti e oggetti in vetro utilizzati durante tutta la procedura sono st…

Discussion

Il saggio matrice di collagene qui descritto è stato utilizzato e migliorato da molti laboratori diversi negli ultimi decenni a indagare su una varietà di molecole e sistemi di orientamento degli assoni neuronali (ad esempio si vedano i riferimenti 5-8). Questi studi hanno dimostrato che questo dosaggio è un potente strumento per studiare gli effetti e la regolazione delle molecole di orientamento degli assoni secrete da diversi (intermedio), tessuti bersaglio.

Tuttavia, occorre notare ch…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il saggio matrice di collagene è stato sviluppato e migliorato dal lavoro di molti gruppi di ricerca diversi nel corso degli ultimi due o tre decenni. Gli approcci descritti qui per espianti dopaminergici e striatali trarre grandi vantaggi da questi studi. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Asheeta Prasad per il suo aiuto nella creazione di culture espianti striatali. Lavorare in laboratorio è stato finanziato dalla Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award), l'Organizzazione olandese di ricerca sulla salute e lo sviluppo (ZonMW-VIDI e ZonMW-TOP), l'Unione Europanian (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222.999) (a RJP), e l'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (TopTalent: per ERES).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Fetal Calf Serum BioWhittaker 14-801F  
Glutamine (200mM) PAA M11-004  
Hepes VWR International 441476L  
β-Mercaptoethanol Merck 444203  
Minimum Essential Media (MEM) Gibco 61100-087  
Neurobasal Gibco 21103-049  
B27 Gibco 17504-044  
Leibovitz’s L-15 Medium Gibco 11415-049  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063  
Prolong Gold Antifade Reagent Invitrogen P36930  
Dialysis tubing Spectrum Labs 132660  
Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase Pel-Freez P40101-0  
Rabbit anti-Darpp32 (H-62) Santa-Cruz Sc-11365  
Mouse anti-βIII tubulin Sigma T8660  
Alexa Fluor labeled secondary antibodies Invitrogen    

References

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Cite This Article
Schmidt, E. R., Morello, F., Pasterkamp, R. J. Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays. J. Vis. Exp. (61), e3691, doi:10.3791/3691 (2012).

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