Este informe describe el uso de imágenes de células vivas y técnicas fotoblanquear para determinar la expresión en la superficie, las vías de transporte y la cinética de la trata de exógena expresó, sensible al pH las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas en la membrana plasmática de las neuronas.
Se describe una estrategia innovadora para visualizar los componentes de la trata de plasma proteína de la membrana. El enfoque combinatorio de photobleaching técnicas con la proteína de septiembre de etiquetado permite selectivamente la membrana de plasma los eventos de inserción que deben evaluarse. Gracias a la continua photobleaching las proteínas de la membrana en las regiones flanqueantes durante la recuperación, el método de "FRAP-FLIP 'evalúa la contribución del tráfico vesicular a la recuperación de la fluorescencia. Este enfoque novedoso permite la grabación directa de inserción proteína de la membrana, lo que permite tanto el número de sub-compartimientos donde se observa la recuperación y la amplitud de la recuperación (Df) en el estado estacionario que se determine. Además, la comparación de FRAP con y sin FLIP permite la proporción de recuperación atribuible a la difusión lateral para ser calculado.
Además, en el mismo experimento, las regiones de no-photobleached dendrita adyacente a las regiones que flanquean photobleached puede serevaluación cualitativa durante la recuperación, la pérdida de fluorescencia observado en estas regiones se debe a la difusión lateral de los receptores de photobleached en estos segmentos no photobleached de la dendrita.
Este protocolo selectivo photobleaching puede ser utilizado para investigar una variedad de procesos celulares tales como el tráfico que caracteriza excocytosis en la membrana plasmática en subáreas definidas (por ejemplo, las dendritas o espinas) FRAP o evaluar la contribución de la inserción lateral de frente de difusión mediante la realización de FRAP paralelo y los -FLIP 'protocolos a lo largo de dendritas adyacentes (Fig. 3).
Es evidente que, mientras que las directrices específicas se han presentado, cada laboratorio deberá optimizar los parámetros de imagen de acuerdo a las muestras y equipos específicos. Es importante destacar que todos los receptores de la superficie en el ROI necesitan ser photobleached, independiente del plano focal del eje z, pero sin daño significativo fototóxico o fotoblanqueo no específica. Nosotrosres deben tener precaución cuando se trata de este protocolo en el soma celular, como el alto porcentaje de los compartimentos intracelulares de pH relativamente bajos por lo general resulta en la fluorescencia de fondo de alta en estas regiones. Además, aunque se ha demostrado que esta técnica se puede aplicar de varias formas, antes de comenzar los experimentos selectivos photobleaching en un nuevo septiembre de etiquetado construir, se aconseja que una caracterización inicial de los receptores marcados se llevó a cabo primero, como se ha descrito por Ashby et al 2.
En general, este método es una adaptación potente y versátil del protocolo estándar de FRAP, lo que permite los eventos de inserción en la membrana plasmática que se evalúan en tiempo casi real.
The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos con el Wellcome Trust y el Coordinador de apoyo financiero. IMGG es un compañero de EMBO. KLH es un estudiante de doctorado BBSRC financiado. Damos las gracias a Philip Rubin y Tidball Patrick para el apoyo técnico y la cultura de células, y el Dr. Andrew Doherty para el mantenimiento y la asistencia con los microscopios.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
24mm glass coverslips | VWR International | 631-0161 | |
Poly-l-lysine | Sigma | P2636 | 1mg/ml in borate buffer to coat coverslips |
Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103 | |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | 2% in neuronal plating and feeding medium |
Penicillin Streptomycin | Sigma | P0781 | 1% in neuronal plating and feeding medium |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 2mM / 0.8mM in plating/feeding medium |
Horse Serum | Biosera | DH-291H | 10% in neuronal plating media only |
pSIN ReP5 cloning vector | Invitrogen | K75001 | For Sindbis virus production |
LSM510 META confocal system | Zeiss | ||
Image J Software | NIH | open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ |