Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Summary

Bu rapor yüzey ekspresyonu, ulaşım yolları ve dışsal olarak ifade edilen, pH-duyarlı GFP-etiketli nöronların plazma membran proteinlerinin kaçakçılığı kinetik belirlemek için canlı hücre görüntüleme ve photobleach tekniklerinin kullanımı anlatılmaktadır.

Abstract

<p class="jove_content"bu reseptörler ve iyon kanalları gibi> Zar proteinleri son derece kutuplaşmış ve morfolojik karmaşık nöron, aktif kaçakçılığı uğrarlar. Bu yönettiği kaçakçılığı, teslim korumak veya sinaptik proteinlerin kaldırmak için temel önem taşımaktadır.</p><p class="jove_content"> Süper ekliptik pHluorin (SEP) oranda plazma membran proteinlerinin canlı hücre görüntüleme beri kullanılmaktadır EGFP bir pH-duyarlı türevidir^1-2. Düşük pH'da SEP'in protonasyon foton emilimini azaltır ve floresans emisyon ortadan kaldırır. Çoğu hücre içi kaçakçılığı olayları Eylül floresans tutulduğu olduğunu düşük pH, SEP-etiketli proteinlerin floresans sinyali ile bölümlerinde meydana geldiğinde SEP nötr pH ekstrasellüler ortama maruz plazma membranından ağırlıklı olarak. Yüksek yoğunluklu Eylül az aydınlatılmış zaman, her floresan boya gibi (photobleached) geri dönüşümsüz fotoyaşlanma olduğunu^3-5. Önemlisi, düşük pH foton emilimi doyurur, çünkü sadece yüzey intrasellüler SEP, yüksek yoğunluklu aydınlatma etkilenmez ise Eylül photobleached edilebilir ifade^6-10.</p><p class="jove_content"sep-etiketli proteinlerin> FRAP (photobleaching sonra floresans kurtarma) plazma membran proteini dinamikleri değerlendirmek için kullanışlı ve güçlü bir tekniktir. Floresan etiketli proteinlerin ilgi bir bölgede photobleached zaman (ROI) floresans kurtarma ağartılmış bölgeye ağartılmamış SEP-etiketli proteinlerin hareketi nedeniyle oluşur. Bu, her iki tarafından sağlanan non-photobleached reseptörlerinin ekzositoz gelen yanal difüzyon ve / veya yoluyla meydana gelebilir<em> De novo</em> Sentezi veya geri dönüşüm (bkz. Şekil. 1). Hareketsiz ve hareketli protein fraksiyonu tespit edilebilir ve difüze fraksiyonun hareketlilik ve kinetik Böyle agonist uygulama ya da bu tür NMDA ya KCl uygulama olarak nöronal aktivasyon uyaran olarak bazal koşullar altında ve uyarılmış sorgulanabilir^8,10.</p><p class="jove_content"> Biz seçici ekzositoz atfedilebilecek floresans kurtarma görselleştirmek için tasarlanmıştır photobleaching teknikleri anlatıyoruz. Kısaca, bir yatırım getirisi komşu bölgeleri ağartma tekrarlayan tarafından, kısa bir kurtarma sonra, takip, standart FRAP protokolleri ile bir kez photobleached edilir. Bizim laboratuarımızda geliştirilen bu 'FRAP-FLIP' protokolü, dendritik dikenler de AMPA reseptör ticareti karakterize için kullanılmıştır¹⁰ Ve intraselüler ticareti ve ekzositoz değerlendirmek için ticareti çalışmaları, geniş bir aralık için de geçerlidir.</p>

Protocol

1. Hücre Kültürü, Viral Transdüksiyon ve Protein Ekspresyonu In vitro (DIV) içinde 14-25 gün süreyle poli-L-Lizin-kaplı cam lamelleri üzerinde embriyonik günde 18 (E18) sıçan yavru kültüre yüksek yoğunluklu hipokampal nöronlar. 6-24 saat önce canlı deneyleri, süper ekliptik pHluorin (SEP) ile etiketlenmiş ilgi membran proteini içeren zayıflatılmış Sindbis virüs iletiminde hücreler. Şartlandırılmış ortam 1mL içeren coverslip doğrudan psödoviriona-içeren orta ekleyin ve kültür inkübatöre geri. Viral iletimi sonrasında protein ekspresyonu için titre ve zaman virüs toplu bağlı olarak değişir ve önceden canlı hücre deneyler başlamadan her parti için belirlenmelidir. 2. FRAP-FLIP Canlı Hücre Görüntüleme Ekipman set-up Zeiss Axiovert LSM 510 META konfokal mikroskop görüntüleme odasına coverslip aktarın.Görüntüleme sırasında güç dalgalanmaları en aza indirmek için, mikroskop görüntüleme önce en az 20 dakika,% 100 lazer çıkışı ile açıldıktan sağlamak. Derhal, önceden ısıtılmış ile kültür ortamı yerini (37 ° C) 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 15 mM glükoz, 1.5 mM CaCI2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM HEPES (pH değerine ayarlanır içeren hücre dışı kayıt solüsyonu NaOH ile 7.4 ') ve Zeiss Axiovert arasında önceden ısıtılmış aşama (37 ° C) üzerine haznesi yerleştirin. Ekstraselüler kayıt çözeltisi osmolarite da kültür ortamı içinde 10 mOsm sağlamak üzere ayarlanmaktadır. Anlamlı buharlaşma deney timecourse sırasında oluşur kaydıyla, bu CO 2 bağımsız çözüm kısa deneyleri (<10 saat) için uygundur. 1-2 mm sodyum bikarbonat ile ilave tavsiye edilir. görüntü yakalama parametreleri tanımlama İlk olarak, rekombinant pro ifade bir nöron tanımlamakilgi protein ve de odak noktası haline getirmek. 63x yağ itiraz, düşük güçte lazer 488nm ışığı uyarım kullanarak tüm hücre kazanır. photobleaching en aza indirmek için, toplam tarama hızı <1 saniye tutarak hızlı nominal hızının (7-9) piksel çözünürlüğü (512-512) kullanın. roi (~ 1.5-2.5 x optik zoom) içeren çerçeve yakalamak resim yakınlaşma dendrit kısmını seçin. mümkün olan yerlerde, spesifik olmayan nedeniyle kazanım oluştuğu olup olmadığını belirlemek üzere, referans dendritler gelen ölçümler elde edilebilir, böylece görüş alanını çeşitli işlemler sağlar. filtreleri, iğne deliği, minimal uyarılma ancak sınırlı doygunluğu maksimum floresans dedektör kazanç sağlamak ayarlayın. büyük deliği çapı (2μm dikenleri üçlü uygundur) foton toplama maksimize etmek, dedektörü kazanç, küçük artışlarla algılayacak kadar güçlü olmalıdırphotobleaching önce ilk görüntüleri, doymuş piksel% 10 üstesinden olmadığı gibi. Önceden > Şekil 1. Bu şematik SEP-tagged reseptörleri kullanarak, bir 'FRAP-FLIP' protokolü karşı düzenli FRAP sonuçlarını göstermektedir FRAP vs FRAP-FLIP protokol müdürleri şematik. Geleneksel FRAP floresans kurtarma sol tarafta gösterilir. Merkez ROI ölçülen floresan kurtarma, geri dönüşüm ve / veya dendritik mile de novo ekzositoz yoluyla photobleached YG ve reseptörlerinin ekleme dışından yanal difüzyon f olmayan photobleached EYL-etiketli reseptörlerinin bir arada atfedilir. Buna karşılık, sağ tarafta gösterildiği kuşatan İB'nin tekrarlayan photobleached gösterir nasıl yanal difüzyon nedeniyle bu modifiye 'FRAP-FLIP' protokolü sessizlikleri kurtarma. Bunun gibi, herhangi bir ölçülen floresan kurtarma ROI doğrudan ekleme atfedilebilir. Şekil 2.Dendritik mil üzerinde plazma zarı içine SEP-GluA2 yerleştirilmesi A) SEP-GluA2 dile getiren bir hipokampal nöron, seçici dendrit bir bölge boyunca photobleached. Sol üst paneli photobleaching için seçilmiştir İB'leri vurgular ederken şematik, görüntülenmiştir edilmiştir dendrit bölgesini göstermektedir. Büyük beyaz kutulu alan çift başlı mavi oklar ile vurgulanan yan kutulu bölgeler, ağartma tekrarlanan ardından, bir kez beyazlatılmış edildi. Bu panel photobleaching öncesinde dendrit gösterir. Kırmızı ok alt paneller yüksek büyütme gösterilen ölçülen yatırım getirisini gösterir. B) Deney süresi boyunca ölçülen yatırım getirisi ile floresans şiddeti, ROI gri düzeyi (normalize değil) olarak çizilmiştir gösterir. Siyah ok ilk photobleach ve yeşil ok timepoint vurgulamak tekrarlayan photobleaching başlangıcını belirtir. Mesafe kadar taşınmış inci gösterirdendritik mile SEP-GluA2 yerleştirilmesi nedeniyle kurtarma dönemde gözlenen floresans e artış. Müteakip düşük pH ve pH 7.4 + NH4CI yıkar kurtarılan floresans ifade reseptörleri yüzey ile ilgilidir onaylayın. Şekil 3. Cyclohexamide tedaviyi takiben dendritik şaft üzerinde Geri Dönüşüm ve SEP-GluK2 lateral difüzyon vs Geri Dönüşüm A) hipokampal nöron paralel FRAP ve ayrı dendritik İB'leri birlikte gerçekleştirilen 'FRAP-FLIP' kurtarma protokolleri ile seçici photobleached SEP-GluK2, ifade. Bu nöron protein sentezi (200 mg / ml az 2 saat) engellemek için cyclohexamide ile ön tabi oldu. Şematik sol paneli photobleaching için seçilmiştir İB'leri vurgulayarak, görüntülenmiştir edilmiştir dendrit bölgesini göstermektedir. The büyük beyaz kutulu alan çift başlı mavi oklar ile vurgulanır alt dendrit sadece bir yan kutulu bölgeler, ağartma tekrarlanan ardından, bir kez beyazlatılmış edildi. Bu panel öncesinde photobleaching için dendritler gösterir. Kırmızı oklar 'FRAP-FLIP' protokolü karşı geleneksel FRAP içinde floresans toparlanma gösteren B yüksek büyütme gösterilen ROI) vurgulayın. Iyileşme geç evre (üçüncü panelleri) floresans şiddet seviyelerinde Karşılaştırmalar yalnız geri dönüşüm karşı yanal difüzyon ve geri dönüşüm katkısını göstermektedir. C) Deney süresi boyunca ölçülen İB'leri içinde floresans yoğunluğu, şiddeti normalize olarak çizilmiştir gösterir değerleri. Siyah ok ilk photobleach ve yeşil ok timepoint vurgulamak tekrarlayan photobleaching başlangıcını belirtir. Mesafe kadar taşınmış rec FRAP / FLIP dendrit tespit reseptör geri dönüşüm nedeniyle geçici iyileşme gösterir iken mesafe kadar taşınmışdiff 'FRAP sadece' yatırım getirisi ile dendritik mile SEP-GluK2 lateral difüzyon katkısını ölçer. Geçici bir artışa cyclohexamide tedavisi bir sonucu olarak kullanılabilir reseptörlerinin çalıştırma aşağıya karşılık gelen sinyal kademeli azalma, takip eder. Sonraki düşük pH ve pH 7.4 + NH4CI yıkar kurtarılan floresans ifade reseptörleri yüzey ile ilgilidir onaylayın.

Discussion

Biz plazma membran proteini ticareti bileşenleri görselleştirmek için yenilikçi bir strateji tanımlamak. SEP-etiketli protein ile teknikleri photobleaching of Kombinatoryal yaklaşım plazma zarı ekleme olaylar değerlendirilmelidir seçici sağlar. Sürekli iyileşme sırasında bölgelere komşu olan membran proteinleri photobleaching olarak, 'FRAP-FLIP' yöntemi floresans kurtarma veziküler ticareti katkısını değerlendirir. Bu yeni yaklaşım belirlenecek kararlı durumda iyileşme gözlenir alt-bölme sayısı ve kurtarma (mesafe kadar taşınmış) genliği sağlayan proteinin membran ekleme doğrudan kayıt sağlar. Ayrıca, FLIP olan ve olmayan FRAP karşılaştırılması hesaplanacak yanal difüzyon kurtarma oranını atfedilebilir sağlar.

Dahası, aynı deney, taarruzcu photobleached bölgeleri bitişik olmayan photobleached dendrit bölgeleri olabilirniteliksel kurtarma sırasında değerlendirilir; bu bölgelerde gözlenen floresans kaybı dendrit bu non-photobleached segmente photobleached reseptörlerinin yanal difüzyon nedeniyle olacak.

Bu seçici photobleaching protokolü gibi (örneğin, dendritler ya omurga) veya paralel FRAP yaparak yanal difüzyon vs yerleştirilmesi katkı değerlendirilmesi ve 'FRAP tanımlandığı subareas plazma membranında excocytosis karakterize olarak hücresel ticareti işlemlerin çeşitli araştırmak için yararlanılabilir bitişik dendritler boyunca-FLIP 'protokolleri (Şekil 3).

Özel yönergeler sunulmuştur ise Açıkçası, her laboratuar spesifik örnekler ve ekipmanları göre görüntüleme parametrelerini optimize gerekir. Önemlisi, ROI tüm yüzey reseptörleri, photobleached z ekseni odak düzlemli bağımsız, fakat önemli fototoksik hasar veya spesifik olmayan photobleaching olmadan gerekir. BizeHücre soma bu protokol çalışırken ers nispeten düşük pH içi genellikle bölümlerinde bu bölgelerde yüksek eşiğe sonuçları yüksek yüzdesi olarak, dikkatli olmalıdırlar. Ayrıca, önceden üzerinde seçici bir photobleaching deney başlamadan, şekillerde değişir bu teknikte uygulanabilir nasıl göstermiştir iken, yeni bir Eylül-etiketli yapı, bu reseptörler etiketlenmiş bir başlangıç ​​karakterizasyonu birinci Ashby ve arkadaşları tarafından açıklanan şekilde, biçimde ifa edildiği hususu tavsiye ^2.

Genel olarak, bu yöntem yakın gerçek zamanlı olarak değerlendirilmek üzere plazma membranında ekleme olaylar sağlayan, standart FRAP protokol güçlü ve çok yönlü bir uyarlamasıdır.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
24mm glass coverslips	VWR International	631-0161
Poly-l-lysine	Sigma	P2636	1mg/ml in borate buffer to coat coverslips
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103
B27	Invitrogen	17504-044	2% in neuronal plating and feeding medium
Penicillin Streptomycin	Sigma	P0781	1% in neuronal plating and feeding medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030	2mM / 0.8mM in plating/feeding medium
Horse Serum	Biosera	DH-291H	10% in neuronal plating media only
pSIN ReP5 cloning vector	Invitrogen	K75001	For Sindbis virus production
LSM510 META confocal system	Zeiss
Image J Software	NIH		open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/