Sintesi di uno<em> In vivo</em> RM-rilevabile Apoptosis Probe
Summary
La diagnosi precoce di apoptosi può identificare a rischio le popolazioni di cellule in una varietà di malattie. Qui mostriamo un metodo per collegare un precoce rilevamento della proteina-apoptosi (annessina V) per una risonanza magnetica-rilevabile nanoparticelle di ossido di ferro (SPIO). Questo metodo può essere esteso ad altre proteine di interesse per generare MRI-rilevabili sonde di imaging molecolare.
Abstract
Apoptosi cellulare è una caratteristica importante di molte malattie, e questa morte cellulare programmata in genere si verifica prima di manifestazioni cliniche della malattia sono evidenti. Un mezzo per rilevare l'apoptosi nelle sue prime fasi e reversibili che garantisca loro un pre-clinica 'finestra' nel corso della quale le misure preventive o terapeutiche potrebbero essere prese per proteggere il cuore dai danni permanenti. Vi presentiamo qui un metodo semplice e robusto di coniugare umana annessina V (ANX), che si lega alle cellule in avidamente le prime, le fasi reversibili di apoptosi, superparamagnetiche di ossido di ferro (SPIO) nanoparticelle, che servono come una risonanza magnetica-rilevabile agente di contrasto. Il metodo inizia con un coniugazione ossidazione delle nanoparticelle SPIO, che ossida gruppi carbossilici sul guscio di polisaccaride SPIO. ANX proteina purificata è poi aggiunto nel contesto di una soluzione di tetraborato di sodio per facilitare l'interazione covalente di ANX con SPIO in un buffer riduzione. Una fase di riduzione finale con sodio borohydride viene eseguita per completare la riduzione, e quindi si spegne la reazione. ANX non coniugato viene rimosso dalla miscela per filtrazione microcentrifuga. La dimensione e la purezza del ANX-SPIO prodotto viene verificata mediante dynamic light scattering (DLS). Questo metodo non richiede aggiunta a, o modifica, il polisaccaride SPIO guscio, al contrario di reticolati metodi particelle di ossido di ferro coniugazione o biotina-etichettati nanoparticelle. Come risultato, questo metodo rappresenta un approccio semplice, robusta che può essere estesa a coniugazione di altre proteine di interesse.
Protocol
Discussion
Il metodo descritto per il collegamento coniugazione SPIO per annessina V sfrutta i gruppi amminici della catena laterale di annessina e le frazioni carbossilici della nanoparticelle SPIO. Attraverso specifici ossidoriduzione passaggi, legame covalente di questi composti può essere raggiunto, e il risultante nanoparticella funzionalizzato può essere isolato. Questo metodo può essere generalizzato ad altre proteine e nanoparticelle di interesse.
Le fasi più critiche sono le condizio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
American Heart Association (JL).
Stanford University, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue # |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
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