בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר סינון הקרינה המיקרוסקופ מבוסס על שתילים ארבידופסיס ומתאר כיצד למפות מוטציות רצסיבי אשר משנים את חלוקת subcellular של סמן מסוים ניאון מתויג במסלול הפרשה. ארבידופסיס הוא מודל ביולוגי רב עוצמה למחקרים גנטיים בגלל גודל הגנום שלו, זמן דור, ושימור של המנגנונים המולקולריים בין הממלכות. מערך genotyping כגישה למפות מוטציה חלופה לשיטה המסורתית המבוססת על סמנים מולקולריים יש יתרון משום שהוא הוא יחסית מהיר יותר עשוי לאפשר מיפוי של מוטציות מספר פרק זמן קצר מאוד. שיטה זו מאפשרת זיהוי של חלבונים אשר יכולים להשפיע על שלמות אברון כל בצמחים. הנה, לדוגמה, אנו מציעים מסך לגנים מפת חשובים שלמות של reticulum endoplasmic (ER). הגישה שלנו, לעומת זאת, ניתן להרחיב בקלות אברונים תאים אחרים צמחים(לדוגמה לראות 1,2), ובכך מייצג צעד חשוב לקראת הבנת הבסיס המולקולרי השולט מבנים subcellular אחרים.
Protocol
1. EMS טיפול זרעים thaliana ארבידופסיס הם mutagenized משתמש כמו sulfonate mutagen אתיל מתאן סוכן (EMS) 3,4, אשר מעוררת את ה-C-ל-T משתנה הגנום וכתוצאה מכך C / G ל T / A מוטציות 5-7. שוקל 0.8 גרם זרעי ?…
Discussion
כאן תיארנו ההקרנה confocal מיקרוסקופיה מבוססת על זיהוי של מוטציות endomembrane. גישה זו ניתן להרחיב בקלות אברונים אחרים של התא עבורו סמנים ספציפיים חלבון פלואורסצנטי הזמינים. המסך מבוסס על זיהוי של מוטנטים המציגים התפלגות חריגה של סמן פלואורסצנטי בין אם אברון היעד או אברונים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים תמיכה על ידי למדעי הכימיה, Geosciences ו Biosciences החטיבה, משרד האנרגיה של יסוד מדעי, משרד המדע, משרד האנרגיה של ארה"ב (מספר הפרס DE-FG02-91ER20021) ואת הקרן הלאומית למדע (MCB 0948584) (FB). אנו אסירי תודה על קרן בירד גב לעריכה את כתב היד.
Stefano, G., Renna, L., Brandizzi, F. Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity. J. Vis. Exp. (62), e3809, doi:10.3791/3809 (2012).