בזמן אמת ההקרנה הליך לזיהוי סמים כי אינטראקציה עם חלבון G-מגודרת פנימה מיישר K<sup> +</sup> (GIRK) ערוצים מתואר. Assay מנצל פוטנציאל רגישות קרום צבעי ניאון כדי למדוד פעילות GIRK הערוץ. טכניקה זו ניתנת להתאמה לשימוש על מספר שורות תאים.
Abstract
G-חלבון סגורות פנימה מיישר K + (GIRK) ערוצים לתפקד כמתווכים הסלולר של מגוון רחב של הורמונים נוירוטרנסמיטורים באים לידי ביטוי השרירים, המוח, הלב ורקמות שלד 1,2 האנדוקרינית. ערוצי GIRK להיות מופעל בעקבות עקידת ligands (נוירוטרנסמיטורים, הורמונים, תרופות וכו ') כדי פלזמה שלהם קרום הנכנס, G חלבונים מצמידים קולטנים (GPCRs). מחייב זה גורם לגירוי של חלבונים G (G I ו-G o) אשר לאחר מכן לאגד ולהפעיל את ערוץ GIRK. פעם אחת פתחתי את ערוץ GIRK מאפשר תנועה של K + מחוץ לתא גורמת קרום מנוחה הפוטנציאל להיות שלילי יותר. כתוצאה מכך, הפעלת GIRK ערוץ בנוירונים פוחתת היווצרות ספונטנית פוטנציאל פעולה מעכב שחרור של שליחים עצביים מעוררים. בלב, הפעלת ערוץ GIRK מעכב פעילות הקוצב ובכך להאט את קצב הלב.
<p= "jove_content" הכיתה> ערוצי GIRK לייצג מטרות חדשות לפיתוח תרופות טיפוליות חדשות לטיפול בכאב נוירופתי, התמכרות לסמים, הפרעות בקצב הלב והפרעות אחרות 3. עם זאת, פרמקולוגיה של ערוצים אלה עדיין נודעת בעיקר. למרות מספר תרופות כולל נגד סוכני בקצב לא סדיר, תרופות אנטי פסיכוטיות וכן תרופות נוגדות דיכאון לחסום את הערוץ GIRK, עיכוב זה אינו סלקטיבי מתרחש בריכוזים גבוהים יחסית סמים 3.
כאן אנו מתארים assay בזמן אמת ההקרנה לזיהוי מאפננים חדשים של ערוצי GIRK. ב assay זה, תאים עצביים AtT20, אשר הביעו את ערוצי GIRK, נטענים עם פוטנציאל רגיש צבעים קרום ניאון כגון bis-(1,3-dibutylbarbituric חומצה) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] או HLB 021-152 (איור 1 ). את מולקולות צבע להיות ספיגת הבאה ניאון חזק אל תוך התאים (איור 1). טיפולשל תאים עם ligands GPCR מגרה ערוצי GIRK לפתוח. כתוצאה K + בזרימת מחוץ לתא גורמת פוטנציאל הממברנה להיות שלילית יותר את האות ניאון כדי להקטין (איור 1). לכן, תרופות לווסת K + בזרימת דרך ערוץ GIRK ניתן ושם ישקלו לו ויעריכו באמצעות הקורא הצלחת ניאון. שלא כמו אחרים ערוץ יון מבחני המיון, כגון ספיגת ספקטרומטריית אטומית 4 או 5 radiotracer ניתוח, assay ערוץ GIRK ניאון מספק בהליך מיון מהיר, בזמן אמת ולא יקר.
Protocol
1. הכנת תאים לגדול יותרת המוח AtT20 תאים במדיום שונה Dulbecco של הנשרים (DMEM) השלימו עם סרום סוס 10% ולשמור על תרבויות על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO 2. לשמור על התרבות התאים על ידי subculturing כ…
Discussion
למרות הפוטנציאל רגישים קרום צבעי ניאון נעשה שימוש כדי לזהות תרופות אשר לווסת תעלות יונים 9,10, זהו הדו"ח הראשון של בקשתם העצבית GIRK ערוץ גילוי תרופות. Assay ערוץ GIRK ניאון המובא כאן מספק שיטה מהירה, אמינה בזמן אמת להקרנה של ליגנד, מגודרת K + ערוצים. Assay ניתן לשנו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ארצות הברית בפרס אישי שירות הבריאות NS-071530.
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
DMEM
CellGro
10-013
Horse serum
Invitrogen
16050-114
96-well plates
Corning
3603
Poly-l-lysine
Sigma-Aldrich
P4707
Somatostatin
Sigma-Aldrich
S9129
Carbachol
Sigma-Aldrich
C4382
HLB 021-152
AnaSpec
89300
Versette automated liquid handler
ThermoFisher
650-01
Synergy2 fluorescent plate reader
Biotek
Gen5 analysis software
Biotek
Table 1. Table of specific reagents and equipment.
Vazquez, M., Dunn, C. A., Walsh, K. B. A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels. J. Vis. Exp. (62), e3850, doi:10.3791/3850 (2012).