Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Summary

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs) usando<strong> Dissociação enzimática da celulose (DPSC-ED)</strong> Ou<strong> Conseqüência direta de células-tronco a partir de explantes de tecido de celulose (DPSC-GO). Seguido por</strong><em> In vitro</em> Diferenciação comparativa dos dois tipos de hDPSCs em odontoblastos.

Abstract

<p class="jove_content"> Dentes do siso em desenvolvimento são de fácil acesso fonte de células-tronco durante a idade adulta, que pode ser obtido por rotina tratamentos ortodônticos. As células-tronco derivadas de celulose (hDPSCs) possuem potencial de proliferação elevado com multi-linhagem capacidade de diferenciação comparar com a fonte normal de células-tronco adultas^1-8 E, portanto, hDPSCs poderiam ser os bons candidatos para transplante autólogo em engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Juntamente com estas vantagens, possuindo as células estaminais mesenquimais (MSC), tais como as características immunolodulatory efeito, fazer hDPSCs mais valioso, mesmo no caso de transplante de aloenxerto^6,9,10. Por conseguinte, o primeiro passo para a utilização dessa fonte de células estaminais é seleccionar o melhor protocolo para o isolamento de hDPSCs de tecido de celulose. A fim de atingir esse objetivo, é fundamental para investigar o efeito de diferentes condições de isolamento em diferentes comportamentos celulares, como os seus marcadores de superfície comuns e também a sua capacidade de diferenciação.</p><p class="jove_content"> Assim, aqui nós separar tecido pulpar humano de terceira impactados dentes molares, e depois usou ambos os protocolos existentes com base na literatura, para hDPSCs isolamento,^11-13<em> Ie</em> Dissociação enzimática do tecido pulpar (DPSC-ED) ou conseqüência a partir de explantes de tecido (DPSC-GO). Nesta matéria, tentamos facilitar os métodos de isolamento, utilizando disco de diamante dental. Em seguida, estas células caracterizadas em termos de estroma associadas Marcadores (CD73, CD90, CD105 e CD44), marcadores hematopoiéticas / endotelial (CD34, CD45 e CD11b), marcador perivascular, como CD146 e também STRO-1. Em seguida, estes dois protocolos foram comparadas com base na potência de diferenciação em odontoblastos tanto pela reacção em cadeia da polimerase quantitativa (QPCR) e coloração alizarina vermelha. QPCR foram utilizados para a avaliação da expressão de genes relacionados com a mineralização (fosfatase alcalina; ALP, matriz extracelular phosphoglycoprotein; MEPE & dentina sialophosphoprotein; DSPP).<sup> 14</sup</p>

Introduction

As células-tronco são células que possuem clonogénicos duas características marcantes, conhecidos como multi-potência e auto-renovação ^15. Entre todas as células estaminais com potências diferentes replicativas, as células estaminais dentários como as células-tronco pós-natais têm chamado a atenção nos últimos anos por causa da sua acessibilidade, plasticidade e capacidade proliferativa elevada em comparação com as células estaminais adultas outros ^16. Caracteristicamente, semelhante para as células estaminais mesenquimais, as células estaminais da polpa dentária são células aderentes clonogénicas que têm a capacidade de diferenciação em múltiplas mesênquima e / ou não-mesênquima linhagens, tanto in vitro como in vivo. ^1-8,17,18 DPSCs são identificados pela a sua expressão negativa de antigénios hematopoiéticas (por exemplo, CD45, CD34, CD14), e da expressão de CD90 positivas, CD29, CD73, CD105, CD44 e STRO-1, ^19,20.

Potencial obtida fácil com o mínimo de dor e morbidade fazer DPSCs humanos como um valiosofonte capaz de MSCs em comparação com as fontes comuns, tais como a da medula óssea as células estaminais mesenquimais ^21. Em geral, DPSCs ter sido isolada por qualquer método outgrowth, isto é, a migração de células estaminais a partir de explantes de tecido de celulose (DPSC-OG) ^22-24, e / ou por digestão enzimática (DPSC-ED) ^4,6,25. Estudos anteriores têm mostrado que o método de isolamento e as condições de cultura podem induzir diferentes populações ou linhagens sob passagens in vitro ^26,27. No caso dos dentes permanentes (pDPSCs), Huang et al mostraram que enzimáticas pDPSCs digeridos têm um maior potencial de proliferação em comparação com os DPSCs crescido. ^{26 Por outro lado,} no caso dos dentes de leite (dDPSCs), demonstrou-se que STRO-1 e CD34 marcadores expressa mais em dDPSC-ED em comparação com dDPSC-OG. Além disso, dDPSC-ED apresentado maior taxa de mineralização em meio definido osteo / odonto. ²⁷ Portanto, devido ao excelente potencial de DPSCs em regenerative medicina, mais estudos serão necessários para uma melhor compreensão das possíveis várias populações que são derivadas de diferentes métodos de isolamento.

Aqui, ela foi a tentativa de introduzir de maneira fácil a extracção da polpa, utilizando-se um passo de disco de diamante dental para facilitar o processo de extracção da polpa. Além disso, após o isolamento de células-tronco derivadas de celulose, aplicando métodos de ED ou OG, propriedades gerais e capacidade de diferenciação entre os dois grupos também foram investigados.

Protocol

1. Prepare a solução de enzima e meio de proliferação (PM) Fazer colagenase tipo I Solução: Pesar colagenase tipo I (12 mg / ml) e dissolver em 1 ml de PBS e de filtro usando um filtro de seringa de 0,2 | im. Em seguida, colocá-lo 15 ml de tubo e mantê-lo a -20 ° C até ser necessário. Solução fazer dispase: Pesar dispase (16 mg / ml) e dissolver em 1 ml de PBS e de filtro usando um filtro de seringa de 0,2 | im. Em seguida, colocá-lo 15 ml de tubo e ma…

Representative Results

DPSCs que foram obtidos por dissociação enzimática (DPSC-ED) são mostrados aqui no dia 10, 15,18 (Figura 1). As colónias iniciadas de modo a formar em quase 3 a 5 dias após o isolamento. DPSCs outgrown (DPSC-OG) são mostrados na Figura 2, no dia 5, 10, 13 & 18. Fibroblast-como as células começaram a migrar a partir do tecido da polpa para o balão através paralelo ordenação por cerca de 5 dias após a semeadura. DPSCs a passagem 3, utilizando os dois métodos…

Discussion

Este protocolo descreve o processo de isolamento e caracterização de hDPSCs da polpa dentária através de dois métodos, dissociação enzimática e excrescência directa de células estaminais a partir de explantes de tecido de celulose. Além disso, a diferenciação in vitro destas células em odontoblastos, foi avaliada por ensaio quantitativo Vermelho de alizarina S & QPCR.

Os protocolos existentes para o isolamento de tecido de polpa de dentes humanos foram uti…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue or Lot. number	Comments (optional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960-5G
L-glutamine	GIBCO	25030-024
Dexamethasone	Sigma	D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control	BD pharmingen	50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control	BD pharmingen	559532
FITC mouse IgG1 κ isotype	BD pharmingen	11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45	BD pharmingen	341071
PE anti-human CD146	BD pharmingen	550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC	Daka	00034418
PE mouse anti-human CD73	BD pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD pharmingen	FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1	BD pharmingen	5553888
CD44 PE mouse anti human	BD pharmingen	555479
Phosphate buffer Solution (PBS)	GIBCO	003000
70-μm cell strainer	Falcon	352360
0.2 μm syringe filter	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm2 culture flask	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan microplate spectrophotometer	Thermo scientific	51119200
Fleurcense Microscope	Olympus
Flowing Software version 2.3.1