Summary

Glasvezel-implantatie voor chronische Optogenetic Stimulatie van hersenweefsel

Published: October 29, 2012
doi:

Summary

De ontwikkeling van optogenetics biedt nu de middelen om nauwkeurig te stimuleren genetische gedefinieerde neuronen en circuits,<em> In vitro</em> En<em> In vivo</em>. Hier beschrijven we de montage en implantatie van een glasvezel voor chronische fotostimulering van hersenweefsel.

Abstract

Het ophelderen van de patronen van neuronale connectiviteit is een uitdaging voor zowel de klinische en fundamentele neurowetenschappen. Elektrofysiologie is de gouden standaard voor het analyseren van patronen van synaptische connectiviteit, maar gekoppeld elektrofysiologische opnames kunnen zowel omslachtig en experimenteel te beperken. De ontwikkeling van optogenetics introduceert een elegante methode om neuronen en circuits stimuleren, zowel in vitro en in vivo een 2,3. Door gebruik celtype specifieke promoter activiteit opsin expressie in discrete neuronale populaties kan men nauwkeurig stimuleren genetisch gedefinieerde neuronale subtypes in verschillende circuits 4-6. Goed beschreven methoden neuronen, inclusief elektrische stimulatie en / of farmacologische manipulaties, stimuleren vaak willekeurig celtype, invasieve en kunnen beschadigen omliggende weefsels. Deze beperkingen kunnen veranderen normale synaptische functie en / of circuit gedrag. Bovendien wegensde aard van de manipulatie, de huidige methoden vaak acute en terminal. Optogenetics biedt de mogelijkheid om neuronen te stimuleren in een relatief onschadelijke wijze en in genetisch gerichte neuronen. De meeste studies met in vivo optogenetics momenteel een optische vezel geleid via een canule geïmplanteerd 6,7, maar beperkingen van deze methode zijn beschadigd hersenweefsel met herhaalde inbrengen van een optische vezel en potentiële breuk van de vezel binnen de canule. Gezien de snel groeiende gebied van de optogenetics, een meer betrouwbare methode van chronische stimulatie is noodzakelijk om op lange termijn studies te vergemakkelijken met een minimale collaterale weefselbeschadiging. Hier geven we onze gemodificeerd protocol als video artikel de werkwijze effectief en elegant beschreven in Sparta et al. vullen. 8 voor de vervaardiging van een glasvezel implantaat en zijn vaste bevestiging op de schedel van verdoofde muizen, en de montage van de fiberoptische koppeling verbinden van het implantaat aan een lichtbron. Het implantaat, verbonden met optische vezels om een solid-state laser, maakt een efficiënte methode om functionele neuronale circuits chronisch photostimulate met minder weefselschade 9 met kleine, afneembare tethers. Permanente bevestiging van de glasvezel implantaten zorgt voor een consistente, op lange termijn in vivo optogenetic studies van neuronale circuits in wakker, gedragen muizen 10 met minimale weefselbeschadiging.

Protocol

* Alle materialen samen met de respectieve fabrikanten en / of leveranciers worden onder het protocol. 1. Montage van Implant Een mengsel van warmte hardbare epoxy glasvezel door toevoeging van 100 mg verharder 1 g hars. Meet en snijd ongeveer 35 mm van 125 urn glasvezel met 100 micrometer kern door het scoren van het met een wig-tip carbide schrijver. Plaats de schrijver loodrecht op de glasvezel en de score in een enkele, unidirectionele beweging. Het snijden van de ve…

Discussion

Optogenetics is een krachtige nieuwe techniek die ongekende controle over specifieke neuronale subtypes mogelijk maakt. Dit kan worden benut moduleren neurale circuits met anatomische en temporele precisie, maar worden de celtype willekeurige en invasieve effecten van elektrische stimulering door een elektrode. Implantatie van glasvezel zorgt voor consistente, chronische stimulering van neurale circuits meerdere sessies in wakker gedragen muizen met minimale schade aan weefsel. Dit systeem, dat oorspronkelijk ontwikkeld…

Acknowledgements

We willen bevestigen dat deze techniek oorspronkelijk beschreven door Sparta et al.., 2012 en is gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in ons laboratorium.

Materials

Name of the Reagent or Equipment Company Catalogue # Comments
LC Ferrule Sleeve Precision Fiber Products (PFP) SM-CS125S 1.25 mm ID
FC MM Pre-Assembled Connector PFP MM-CON2004-2300 230 μm Ferrule
Miller FOPD-LC Disc PFP M1-80754 For LC ferrules
Furcation tubing PFP FF9-250 900 μm o.d., 250 μm i.d.
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm PFP MM-FER2007C-1270 127 μm ID Bore
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm PFP MM-FER2007C-2300 230 μm ID Bore
Heat-curable epoxy, hardener and resin PFP ET-353ND-16OZ  
FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk ThorLabs D50-FC For FC ferrules
Digital optical power and Energy Meter ThorLabs PM100D Spectrophotometer
Polishing Pad ThorLabs NRS913 9″ x 13″ 50 Durometer
Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits ThorLabs LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P  
Standard Hard Cladding Multimode Fiber ThorLabs BFL37-200 Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA
Fiber Stripping Tool ThorLabs T10S13 Clad/Coat: 200 μm / 300 μm
SILICA/SILICA Optical Fiber Polymicro Technologies FVP100110125 High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA
1×1 Fiberoptic Rotary Joint doric lenses FRJ_FC-FC  
Mono Fiberoptic Patchcord doric lenses MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC  
Heat shrink tubing, 1/8 inch Allied Electronics 689-0267  
Heat gun Allied Electronics 972-6966 250 W; 750-800 °F
Cotton tipped applicators Puritan Medical Products Company 806-WC  
VetBond tissue adhesive Fischer Scientific 19-027136  
Flash denture base acrylic Yates Motloid ColdPourPowder+Liq  
BONN Miniature Iris Scissors Integra Miltex 18-1392 3-1/2″(8.9cm), straight, 15 mm blades
Johns Hopkins Bulldog Clamp Integra Miltex 7-290 1-1/2″(3.8 cm), curved
MEGA-Torque Electric Lab Motor Vector EL-S  
Panther Burs-Ball #1 Clarkson Laboratory 77.1006  
Violet Blue Laser System CrystaLaser CK473-050-O Wavelength: 473 nm
Laser Power Supply CrystaLaser CL-2005  
Dumont #2 Laminectomy Forceps Fine Science Tools 11223-20  
Probe Fine Science Tools 10140-02  
5″Straight Hemostat Excelta 35-PH  
Vise with weighted base Altex Electronics PAN381  

References

  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  2. Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
  3. Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
  4. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
  5. Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
  6. Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
  7. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
  8. Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
  9. Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
  10. Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).

Play Video

Cite This Article
Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue. J. Vis. Exp. (68), e50004, doi:10.3791/50004 (2012).

View Video