Summary

В ово выражения микроРНК в Брюшной Chick мозга

Published: September 16, 2013
doi:

Summary

Внематочная выражение одна техника для выяснения роли микроРНК в развитии мозга. Тем не менее, ориентированные на конкретные области применения в ово электропорации является сложной задачей. Здесь мы покажем это эффективный способ выборочно электропорации брюшной и спинной среднего мозга регионы.

Abstract

Некодирующих РНК дополнительные игроки в регуляции экспрессии генов. Целевые в ово электропорации конкретных областях предоставляет уникальный инструмент для пространственного и временного контроля эктопической экспрессии микроРНК. Тем не менее, брюшные структуры мозга, как брюшной мозга довольно трудно достичь за любые манипуляции. Здесь мы демонстрируем эффективный способ электропорации микроРНК в брюшной мозга с помощью тонких платиновых электродов. Этот метод предлагает надежный способ трансфекции конкретных областей мозга и полезный инструмент для естественных условиях исследования в.

Introduction

Признание малых некодирующих РНК в качестве дополнительных игроков для экспрессии генов запустила новый сложность геномной регуляции программирования / генов. Различные виды некодирующих РНК имеют функциональное значение в нервных клетках, в том числе малого некодирующих РНК 1-4. Микро РНК (микроРНК или микроРНК), например отчетливые и меняющиеся профили экспрессии в развивающихся мозгах 5. Целевые в ово электропорации куриных эмбрионов обеспечивает уникальная возможность для временной и пространственной контроля экспрессии генов и молчания во время развития.

Это видео демонстрирует различные этапы выполнения эктопическая экспрессия Мирс в конкретных областях куриного мозга использования в ово электропорации 6-10. Для обеспечения длительный эффект этих маленьких некодирующих РНК в клетках, последовательность ДНК Мирс, были клонированы в моно-или би-cistronic векторов. Ибо в ово электропорации, микроРНК, содержащий VEctor вводят в среднего мозга нервной трубки, подвергая эмбрион после внесения небольшое окно в яичной скорлупы. Для трансфекции конкретных областей среднего мозга небольшом плюсе (анод) и минус (катод) платиновые электроды размещаются на определенных позициях. Для среднего мозга вентральной трансфекции, анод находится под левой вентральной мозга и катодом над правой половине мозга перед нанесением ток. Отверстие в скорлупе закрывают лентой и эмбрионы инкубировали в течение тех пор, пока требуется для любого анализа. Этот метод первоначально был описан Мурамацу соавт. 6 и улучшить Momose соавт. 8 для конкретной области трансфекции.


Принципиальная Обзор.

  1. Эмбрион в яйце подвергается путем разрезания небольшое окно в гоэ яичной скорлупы.
  2. Растворенный вектор (ы) вводят в мозге с помощью микро капилляр.
  3. Два электрода – размещенные параллельно или под и над эмбриона – генерировать импульсного электрического поля.
  4. Электрическое поле временно создает поры в клеточной мембране, которые облегчают вход в клетку отрицательно заряженным ДНК (или РНК) привлек к аноду 11,12.

Protocol

1. Требования к In ово электропорации Подготовка векторную конструкцию: Мир смыслового и антисмыслового праймеров были разработаны после инструкциями Ambion, отжигают и лигируют в ApaI / EcoRI переваривается pSilencer U6.1 вектор. После успешной трансформации одной из полученных …

Representative Results

Степень среднего мозга области трансфицированных микроРНК виден через экспрессии GFP от репортерного вектора вводимого вместе с экспрессирующим вектором Mir (рис. 2). Использование платиновые электроды с диаметром 0,5 мм и расположены параллельно оси AP среднего мозга приводит об…

Discussion

Это видео демонстрирует эффективный метод для трансфекции плазмиды в нейроэпителиальных клетках конкретных областях куриного мозга. Прямоугольные электрические импульсы низкого напряжения можно ввести ДНК в клетках кур нервной трубки в ово 6,16. Однако точность таргетинга…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем, К. Mikic, кто внес вклад в начальной фазе этого фильма и М. Николеску для картины микроРНК. С. Хубер была поддержана общение в IZKF от Universtitätsklinikum Тюбинген, А. Alwin Прем Ананд по программе состоянием на Universtitätsklinikum Тюбингене.

Materials

Name Company Model
Borosillicate glass capillaries Hartenstein Model: 0.9 mm
Microcapillary puller WPI, Berlin Model: Pul1-E
Electroporator Intracel Model: TSSIC
Stereomicroscope – fluorescence LEICA Model: MZFLIII
Stereomicroscope Zeiss Model: Stemi
Camera and software Zeiss Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8

References

  1. Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
  2. Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
  3. Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
  4. Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
  5. Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
  6. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
  7. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
  8. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
  9. Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
  10. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
  11. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
  12. Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
  13. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
  14. Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. , 294-2119 (2006).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
  16. Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
  17. Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).
  18. De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).

Play Video

Cite This Article
Huber, C., Prem Anand, A. A., Mauz, M., Künstle, P., Hupp, W., Hirt, B., Wizenmann, A. In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain. J. Vis. Exp. (79), e50024, doi:10.3791/50024 (2013).

View Video