Spierfunctie metingen bijdragen tot de evaluatie van potentiële therapeutische middelen voor spier pathologie, evenals de bepaling van mechanismen fysiologie van dit weefsel. We zullen aantonen de voorbereiding van de m. extensor digitorum longus en het middenrif spieren voor functionele testen. Protocollen voor isometrische en excentrische contracties zal worden getoond, evenals de verschillen in resultaten tussen dystrofische spieren, wat neerkomt op een pathologische toestand, en wildtype spieren.
Cruciaal belang voor de evaluatie van potentiële therapeutische middelen voor spierziekte gevoelig en reproduceerbaar fysiologische beoordeling van spierfunctie. Omdat veel pre-klinische studies rekenen op muismodellen voor deze ziekten, heeft geïsoleerde spierfunctie uitgegroeid tot een van de normen voor Go / NoGo beslissingen bij het verplaatsen van kandidaat-geneesmiddelen naar voren in patiënten. We demonstreren de bereiding van de extensor digitorum longus (EDL) en middenrif voor tests, die voornamelijk spieren gebruikt voor deze studies. De EDL spier geometrie is ideaal voor geïsoleerde spier preparaten met twee gemakkelijk toegankelijke pezen en een klein formaat dat kan worden ondersteund door superfusie in een bad. Het membraan vertoont diepe progressieve pathologie in dystrofische dieren, en kan dienen als een platform voor het evalueren van veel potentiële therapieën tegengaan van fibrose, en het bevorderen van myofiber stabiliteit. Protocollen voor het routinematig testen, met inbegrip van isometrische en eccentric contracties getoond. Isometrische kracht levert beoordeling van sterkte en excentrische contracties helpen sarcolemma stabiliteit, hetgeen wordt verstoord in vele soorten spierdystrofieën evalueren. Vergelijkingen van de verwachte resultaten tussen spieren van wild-type en dystrofische spieren zal ook worden verleend. Deze maatregelen kunnen aanvullen morfologische en biochemische metingen van weefsel homeostase, alsmede gehele dier beoordeling van spierfunctie.
Spierfunctie metingen bijdragen tot de evaluatie van mogelijke behandelingen van spier pathologie, evenals de bepaling van mechanismen fysiologie van dit weefsel. Voor spierziekte, hebben het gebruik van muismodellen uitgegroeid tot een centraal onderdeel voor het begrijpen van de relatie tussen genotype en fenotype, en voor de uitbreiding van die kennis in het ontwerpen en testen van mogelijke therapeutica. De spierdystrofieën, in het bijzonder, hebben vertrouwd op muizen om deze middelen te evalueren en pre-klinische gegevens die nodig zijn om verder te gaan naar onderzoeken bij patiënten vast te stellen. Een frequent gebruikt uitkomstmaat geïsoleerde spier functie kracht, die van toepassing is op een groot aantal studies bepalen. Een andere maatregel is het gebruik van excentrische of verlenging, contracties bepalen veranderingen in spier membraan integriteit, die deficiënt is in Duchenne spierdystrofie en het muismodel voor deze ziekte (mdx). Daarom is het voor dit soort Metingents gevoelig en reproduceerbaar.
De muis extensor digitorum longus (EDL) spier is veelvuldig gebruikt voor geïsoleerde spierfunctie vanwege de ideale geometrie en afmetingen, waaronder uniforme vezeloriëntatie en definitieve pezen 2, 5, 6, 10, 12. Werkwijzen voor EDL spieren isometrisch functionele metingen zijn beschreven in een eerdere publicatie Jupiter 8, en in de behande-NMD SOP 1. We hebben uitgebreid de beschrijving van deze methoden om zowel isometrische en excentrische contracties op te nemen. Kenmerken van de ziekte zijn duidelijk in de EDL, met inbegrip van heighted cycli van degeneratie / regeneratie en verminderde kracht output.
De muis membraan vertoont de snelste pathologische progressie van spierdystrofie vergelijking met andere spieren in de muis 11. Door leeftijd van 6 maanden, cumulatief fibrose omvat ongeveer 50% van de spier. Dit resulteert in aanzienlijk slechtziendend kracht uitgang 11. Daarom kunnen geneesmiddelen met fibrotische infiltratie voorkomen efficiënt worden geëvalueerd in het membraan.
Het verlies van dystrofine in de spieren leidt tot een verhoogde kwetsbaarheid en verhoogde contractiele schade in alle spieren 9. Daarom zijn er veel therapieën voor de ziekte van Duchenne zijn afgestemd op dystrofine vervanging. Als zodanig een assay die essentieel is geworden voor het evalueren van deze strategieën is excentrische contractie, die onderscheid kunnen maken tussen normale en dystrofische spier, en bepalen welk voordeel een bepaalde strategie voor het beschermen van dystrofe spierweefsel contractiele schade 2, 3, 4, 12. Deze procedure vereist een dual-mode servo-motor die moduleren / recordlengte en kracht, of een werkwijze voor het aanpassen lengte snel los van een krachtopnemer.
Het doel van dit artikel is om een leidraad voor het uitvoeren van geïsoleerde spierfunctie op twee spieren van muizen – de EDL en het middenrif. Evaluatie van deze spieren kan inzicht geven in het al dan niet therapeutische kandidaten voor spierziekte nuttig zijn. Voor beide spieren, de belangrijkste factor bij het verkrijgen van betrouwbare gegevens is een schone dissectie. Daarom oefenen en perfectioneren van de oorspronkelijke isolatie stap is essentieel alvorens op functionele testen. Bovendien, tot oprichting van functionele maatstaven voor normale spier is van cruciaal belang voor het maken van vergelijkingen met dystrofische spieren, of tussen de behandelingen. Dit zorgt ervoor dat de onderzoeksresultaten niet onder hoge variabiliteit verleend door het vermogen van de persoon die de experimenten. Het gebruik van een membraan impermeant kleurstof kan helpen bij het optimaliseren van de dissectie preparaat, incubatie van elke spier in een oplossing die een dergelijke kleurstof meest beschadigde vezels markeren, en kan dienen als een index van dissection succes. Minimaliseren van het aantal vezels in de spier beschadigd zal helpen om de meting te optimaliseren. De vezels beschadigd door dissectie fluoresceren veel feller dan beschadigd door excentrische contractie en dus als de kleurstof wordt eveneens gebruikt voor de mechanische proces, kan de intensiteit van kleurstof gebruikt om onderscheid te maken tussen de twee soorten schade.
Dissectie van membraan strips zullen bijna altijd vezelbeschadiging, omdat door te snijden langs de lengte van de vezels, wat onvermijdelijk kapot gaat. Dye opname sterk in de beschadigde vezels en deze zijn normaal beperkt tot de buitenranden van het preparaat. Gemiddeld zien we een band van beschadigde vezels die ~ 3 vezels in breedte (~ 120 um) aan weerszijden van de spier strip. Als de beschadigde band omvat meer dan 15% van de spier, worden de gegevens verwijderd. Het membraan voorbereiding heeft ook beperkingen op de optimale grootte voor functionele maatregelen. We hebben gevonden dat stukken diaphragm breder dan 5 mm beginnen te vouwen op zichzelf, omdat de centrale pees tie slechts in een punt. Dit resulteert in een verminderde specifieke kracht in het preparaat. We hebben ook ontdekt dat smallere stroken ook lager specifieke kracht, waarvan wij geloven dat hebben, omdat het aantal vezels beschadigd tijdens dissectie bestaan uit een groter deel van de totale vezelmassa nummer. Als bijvoorbeeld 0,1 mm aan elke kant is beschadigd, dat 5% (2×0.1 mm / 4 mm strip) van de spier preparaat dat niet bijdraagt aan dwingen, terwijl indien de strip slechts 1 mm, vervolgens 20 % van de spiervoorbereiding beschadigd. Dus zowel de breedte van het beschadigde gebied en de breedte van het gehele preparaat belangrijke factoren te controleren.
Metingen van maximale isometrische spanning vereisen dat alle spiervezels in een spier worden gestimuleerd. Omdat er een enorme variabiliteit in de componenten van een functie inrichting, moet dit worden bepaald voor elke afzonderlijke setup. Zo kan bad grootte of het type stimulator invloed op de intensiteit van de stimulatie. Twitch stimulatie is een redelijke manier om supramaximale stimulatie voorwaarden te bepalen. Zodra dit is vastgesteld voor een specifieke situatie en spieren, kan het worden gebruikt voor verdere studies.
In tegenstelling tot de optimale lengte van een gegeven spier moet worden gemeten voor elk preparaat met de iteratieve proces hierboven beschreven. Dit zorgt ervoor dat dikke en dunne filamenten overlap is optimaal en de maximale potentiële kracht genererende capaciteit wordt gemeten. Alternatieve procedures kunnen rekenen op de diffractie patronen die door de spier strepen, maar dit vereist extra apparatuur hier niet beschreven.
We routinematig gebruik 500 msec stimulatie lengtes, dat valt in het middengebied van deze parameter worden gebruikt door andere onderzoekers op dit gebied. Hoewel dit enkele vermoeidheid van de spier veroorzaken tijdens de contractie, zoals blijktdoor een "sag" in de maximale kracht productie kan dit op zichzelf informatief. Zo zou een verschil in vermoeidheid worden bereikt door verschillende therapieën, waaronder die welke beogen calcium behandeling, vandaar de doorbuiging die tijdens actieve contractie kan dienen als een index voor verbetering. Alternatief kan het verlies van kracht dan dat de hechtingen op de pezen niet stevig genoeg, en dat zij glijden tijdens de contractie. De spier wordt verwijderd uit het bad en de hechtingen opnieuw worden verbonden als dit gebeurt. We gebruiken ook een reeks van 3 tetanische contracties, waardoor evaluatie van de stabiliteit van het preparaat. Nogmaals, zou hechtdraad slips leiden tot verlies van kracht tussen de weeën, die hechting opnieuw koppelverkoop. Grote spieren kan ook leiden tot anoxische kernen, die leiden tot verlies van geweld tijdens het protocol. Spiermassa is een beperkende factor voor het uitvoeren van geïsoleerde spierfunctie testen, waar EDL spieren met massa's van meer dan 20 mg te verliezen kracht bij elke contractueletie, en kan niet worden ondersteund door superfusie in een bad. Membraan strips hebben geen last van dezelfde complicaties, omdat ze dun genoeg om langdurige levensvatbaarheid hebben in het bad.
Andere spieren kan worden gebruikt voor geïsoleerde spier functie, met inbegrip soleus, die gewoonlijk wordt gebruikt, maar hier niet beschreven. Veel van dezelfde procedures kunnen worden vastgesteld voor de soleus in termen van het preparaat en de functionele testen. De belangrijkste verschillen zijn in de stimulatie frequentie en de parameters voor excentrische contracties. Gebruik van de soleus voor functie vult die van de andere twee spieren, en daarom moet worden beschouwd als onderdeel van een "standaard pakket" gaan dystrofe muizen 4, 7.
Excentrische contractie geeft een index van contractiele breekbaarheid en het is belangrijk om een protocol dat resulteert in verlies van bescheiden werking in spieren van wildtype dieren een aanzienlijk verlies van kracht inonbehandelde dystrofische spieren zodat er een groot dynamisch bereik voor vergelijkingen. Een gebrek aan kracht verliezen in normale spieren suggereert dat de excentrische contractie te mild en niet toereikend te onderscheiden therapieën die niet effectief en die echt gunstig. Echter, een dramatisch verlies van kracht in de normale spieren onderworpen aan excentrische contractie te groot om te plagen uit verschillen die verband houden met de ziekte. Onze protocol voor de EDL en het middenrif maakt gebruik van een 0,5 Lo / sec stretch tarief voor de productie van een 10% lengteverandering. We voeren gewoonlijk 5 excentrische contracties, die resulteren in een klein verlies van kracht in normale spieren en een significant verlies van werking in dystrofische spieren. Uiteraard kunnen al deze parameters worden gevarieerd om de lengte veranderen, de mate van rek, of het aantal excentrische contracties verhogen om verschillen tussen zieke en gezonde spier, alsmede de effecten van een bepaald type mutatie onderscheiden of tEHANDELING men studeert. Zolang er een duidelijk verschil tussen normale en aangetaste spieren, dan is er een gouden standaard te bereiken in termen van behandelingen.
Kortom, dit protocol worden richtsnoeren vastgesteld voor het uitvoeren van isometrische en excentrische contracties, en hopelijk identificeert de mogelijke valkuilen te vermijden bij het instellen van deze techniek in uw lab.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Paul D. Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
in vitro Muscle Test System | Aurora Scientific | 1200A | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | |
ACE light source | Schott-Fostec | A20500 | |
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | alternate dissecting tool |
Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012-00 | alternate dissecting tool |
Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
S&T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
Dumont SS forceps – angled | Fine Science Tools | 11203-25 | |
Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07-30-10 | |
Medical tape | Transpore | 3M | |
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409-2051-05 | Final Dose is 80 mg/kg |
TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vedco | NDC 50989-234-11 | Final Dose is 10 mg/kg |
Reactive orange 14 | Sigma-Aldrich | R-8254 | |
Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4 | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | Final Concentration: 4.7 mM |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Final Concentration: 2.5 mM |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P-285 | Final Concentration: 1.2 mM |
Magnesium sulfate | J.T. Baker | 2500-01 | Final Concentration: 0.57 mM |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP310-500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |