واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات<em> في الجسم الحي</em> استخدام التنشيط بواسطة Cotranslational انشقاق (CoTrAC)
Summary
وصفنا طريقة المجهر مضان، شركة متعدية تنشيط من قبل انشقاق (CoTrAC)، لإنتاج صورة جزيئات البروتين في الخلايا الحية مع واحدة جزيء الدقة دون احداث بلبلة وظيفة البروتين. وقد استخدم هذا الأسلوب لمتابعة ديناميات التعبير العشوائية من عامل النسخ، وقامع λ CI<sup> 1</sup>.
Abstract
وصفنا طريقة المجهر مضان، شركة متعدية تنشيط من قبل انشقاق (CoTrAC) لإنتاج صورة جزيئات البروتين في الخلايا الحية مع واحدة جزيء الدقة دون احداث بلبلة وظيفة البروتين. هذا الأسلوب يجعل من الممكن لحساب عدد جزيئات البروتين التي تنتج في خلية واحدة خلال متتابعة، ويندوز غضون خمس دقائق. يتطلب المجهر مضان مع الإثارة ليزر كثافة قوة كيلوواط 0،5 حتي 1 ~ / سم 2، وهي حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن جزيئات البروتين واحد الفلورية في الخلايا الحية. مراسل الفلورية المستخدمة في هذا الأسلوب يتكون من ثلاثة أجزاء: سلسلة استهداف الغشاء، وهي سريعة النضج، بروتين فلوري الصفراء وتسلسل الاعتراف البروتيني. وتنصهر translationally مراسل لمحطة-N من البروتين من الفائدة. تزرع الخلايا على مرحلة المجهر التحكم في درجة حرارته. كل خمس دقائق، وتصوير جزيئات نيون داخل الخلايا (وشارك في وقت لاحقمن خلال تحليل الصور unted مضان) وبعد ذلك photobleached بحيث يتم عد البروتينات حديثا فقط ترجمت في قياس المقبل.
ويمكن تحليل الصور مضان الناتجة عن هذه الطريقة عن طريق الكشف عن البقع الفلورية في كل صورة، وتكليف لهم لخلايا فردية ومن ثم تعيين الخلايا لالأنساب الخلية. يتم حساب عدد من البروتينات التي تنتج داخل نافذة الوقت في خلية معينة بقسمة كثافة مضان متكاملة من البقع من جزيئات الشدة متوسط الفلورسنت واحدة. استخدمنا هذا الأسلوب لقياس مستويات التعبير في حدود 0-45 الجزيئات في واحدة 5 دقائق الوقت في Windows. تمكين هذه الطريقة لقياس الضوضاء لنا في التعبير عن CI قامع λ، ولها العديد من التطبيقات المحتملة الأخرى في بيولوجيا الأنظمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن للطريقة CoTrAC يمكن تعميمها لقياس إنتاج بروتينات أخرى حيث N-C-التقليدية أو محطة اندماج بروتين فلوري قد وقف نشاط البروتين. استراتيجية CoTrAC ثلاثة مزايا فريدة على الطرق الحالية. الأولى، وشارك في متعدية الانصهار يضمن أن يتم إنتاج جزيء واحد لمراسل الفلورسنت لكل جزيء من ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعود الفضل في بلازميد معربا عن pCG001 في Ubp1 بيكر روهان في مدرسة جون كورتين للأبحاث الطبية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مارس من الدايمات البحث المنح 1-FY2011 مارس من الدايمات جائزة باسل كاتب أوكونور الباحث بحوث # 5 FY20 وNSF جائزة CAREER 0746796.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).
- Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
