Summary

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Published: February 02, 2013
doi:

Summary

Мы описываем одноклеточных высокой пропускной способностью анализа для оценки цитотоксичности Т-клеток при инкубации с опухолевыми клетками-мишенями. Этот метод используется плотная, эластомерных массив к югу от nanoliter скважин (~ 100000 скважин / массив) для пространственно ограничить Т-клетки и клетки-мишени в определенных соотношениях и соединен с флуоресцентной микроскопии для контроля эффекторных-целевого сопряжения и последующего апоптоза.

Abstract

Иммунотерапии рака могут использовать специфику иммунного ответа на цель и устранения опухоли. Приемные клеточная терапия (АКТ) на основе приемных передачи Т-клеток, генетически модифицированные, чтобы выразить химерный рецептор антигена (CAR) показали значительные перспективы в клинических испытаниях 1-4. Есть несколько преимуществ использования CAR + Т-клеток для лечения рака, включая возможность направлять не-MHC антигенов и ограниченных к функционализации Т-клетки для оптимального выживания, самонаведения и настойчивость в принимающей, и, наконец, чтобы индуцировать апоптоз CAR + Т-клетки в случае хозяин токсичности 5.

Разграничении оптимальной функции CAR + Т-клеток, связанных с клинические преимущества имеет важное значение для разработки следующего поколения клинических испытаний. Последние достижения в области изображений живых животных, как многофотонной микроскопии революцию в изучении функции иммунных клеток яп естественных 6,7. Хотя эти исследования расширили наше понимание Т-клеточной функции в живом организме, Т-клеточной основе СПО в клинических испытаниях требует необходимость увязки молекулярные и функциональные особенности Т-клеточных препаратов предварительной инфузии с клинической эффективности после инфузии, с использованием в лабораторных анализов мониторинг Т-клеточной функции, такие как, цитотоксичности и секрецию цитокинов. Стандартный проточной цитометрии на основе анализа были разработаны, которые определяют общее функционирование популяций Т-клеток в одной клетке уровне, но они не пригодны для мониторинга формирования и сопряженных жизни или способности и той же клетке, чтобы убить несколько целей 8.

Microfabricated массивов разработан в биосовместимые полимеры, такие как полидиметилсилоксана (PDMS) являются особенно привлекательным методом пространственно ограничить эффекторов и мишеней в небольших объемах 9. В сочетании с автоматической покадровой флуоресцентной микроскопии, Тхоusands эффекторных-целевого взаимодействия могут быть проверены одновременно визуализации отдельных скважин из массива nanowell. Мы приведем здесь высокой пропускной методологии мониторинга Т-клеточной цитотоксичности на одной клеточном уровне, которые могут быть широко применены к изучению цитолитического функциональности Т-клеток.

Protocol

1. Подготовка реагентов Подготовка RPMI-PLGH путем смешивания 500 мл RPMI-1640 и 5 мл каждого из пенициллин-стрептомицина, L-глутамин, и решение HEPES. Подготовка R10 решение путем смешивания RPMI-PLGH с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). FBS является инактивированной нагреванием при 56 ° С в …

Representative Results

Примером применения высокой пропускной цитолитического анализа показано, на рисунке 2. Короче говоря, помечены CD19 конкретных CAR + Т-клетки инкубируют с меченым мыши EL4 клетки-мишени в отдельных скважинах массива nanowell (разделы 1-5). Исходное изображение было записано на авто…

Discussion

Мы наметили протокол для высокой пропускной способности одноклеточных цитолитического анализа включается с помощью совместной инкубации эффекторов и мишеней в массивах nanowells (рис. 1). В дополнение к пропускной Основным преимуществом метода является возможность контролирова…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследования в этом сообщило издание было поддержано Национальным институтом рака Национального института здоровья под Премия Количество R01CA174385. Этот материал предназначен исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института здоровья.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine Cellgro 15-040-CV  
Penicillin-streptomycin Cellgro 30-002-CI 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine Cellgro 25-005-CI 200 mM solution
HEPES Sigma Aldrich H3537 1M
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150 Lot tested
Cell Tracker Red Stain Invitrogen C34552 50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain Invitrogen V35003 5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain Invitrogen S7020 5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647 Invitrogen A23204 500 μl
Dulbecco’s PBS Cellgro 21-031-CV 500 ml
Noble agar DIFCO 2M220 100 g
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154 0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer Hausser Scientifics 1492 Bright line
4-well plate Thermo Fisher 167603  
Harrick Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G Basic plasma cleaner
Observer.Z1 ZEISS   Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3 Sutter Instrument   Filter controller
Lambda DG-4 Sutter Instrument   Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera Hamamatsu C9100-13 CCD-Microscope camera
15 ml conical tube BD Falcon 352097  
50 ml conical tube VWR 3282-345-300  
Nikon Biostation Nikon Instruments Inc. Biostation IM  
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0 35 mm petri dish, 10 mm microwell

References

  1. Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
  2. Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
  3. Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
  4. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. , (2011).
  5. Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
  6. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  7. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
  8. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
  9. Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
  10. Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
  11. Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
  12. Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
  13. Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
  14. Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).

Play Video

Cite This Article
Liadi, I., Roszik, J., Romain, G., Cooper, L. J., Varadarajan, N. Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells. J. Vis. Exp. (72), e50058, doi:10.3791/50058 (2013).

View Video