生物质的使用限制金额高效的染色质免疫沉淀

Summary

我们描述了一个可靠的方法，使用的主要的T细胞染色质免疫沉淀。该方法是建立在标准的方法，但使用一组特定的条件和试剂，提高效率有限的数量的细胞。重要的是，在数据分析阶段的详细描述。

Abstract

染色质免疫沉淀技术（ChIP）是一种广泛使用的方法，用于确定不同的蛋白质与DNA的活细胞染色质的相互作用。的实例包括序列特异性DNA结合转录因子，组蛋白和其不同的修改状态，如RNA聚合酶和辅助因子，酶，DNA修复组件。尽管它的无处不在，有缺乏到最新的，详细的工作台上准备材料的准确的分析，使相互作用的定量度量方法。由于缺乏这方面的信息，并且，因为，像任何免疫沉淀的条件，必须重新优化的一组新的实验条件下，ChIP分析容易不准确或低定量的结果。

我们的协议是最终来自转录因子：DNA的相互作用^1,2开创性的工作，但影响与采用了多项改进VITY和再现性难以取得的细胞类型。该协议已经被成功地使用^3,4，都使用定量PCR，定量DNA浓缩，或使用以下协议的变体，一种半定量。

进行PCR扩增的材料，这种定量​​分析计算，并表示在测定中的一个限制因素。重要的控制及其他考虑因素包括使用的同种型匹配的抗体，以及评价的一个控制区域的基因组DNA，如预测由所研究的蛋白质（或预计不被束缚的间隔区不显示变化下本实验条件下）。此外，输入材料的每一个的ChIP样品的标准曲线是用来推导出在实验材料的绝对水平的富集。使用标准曲线，可以考虑到引物组之间的差异，无论它们被设计的仔细，效率也不同整个范围内的模板浓度为一个单一的引物组的分配办法。我们的协议是不同于其他^5-8中，我们广泛覆盖后，分析阶段。

Protocol

1。分离小鼠脾幼稚的CD4 T细胞牺牲了鼠标，以人道的方式，符合机构的动物护理和使用委员会（IACUC）协议。解剖脾，并将其放置在培养皿中含有10毫升含10％FBS的DMEM。 粉碎使用磨砂两端的两个载玻片释放脾脾。细胞悬液转移15毫升锥形管中。 通过离心收集细胞，在200×g离心（〜1,200 rpm下一个典型的转子直径的临床离心机）5分钟，在4℃下将细胞重新悬浮在2ml ACK缓冲液…

Representative Results

染色质免疫沉淀（ChIP）提出的协议控制的差异，如果有的话，通过使用一个未绑定的基因组区域的引物对，放大DNA用于PCR的金额，因此作为“负荷控制”。在图3中所示的例子中，我们已经使用鼠标Actb的基因的编码区作为未结合的蛋白，小鼠IL2作为目标区域的启动子上的兴趣和转录因子NFAT结合位点的区域。另外，几个千碱基的区域的上游或下游已知有感兴趣的蛋白质没?…

Discussion

上述协议提供了一种可靠的方法准确地量化使用芯片的主要淋巴细胞DNA富集。在这个协议的鲁棒性的主要原因之一是列入生物复制。上述协议使用三个重复，这是独立计算的富集。然后平均的输出提供一定程度的富集和标准偏差计算提供一定程度的变异。对于每个样品，三个技术也进行消除变化的样品处理，PCR扩增等的技术重复的变化量通常远小于所观察到的不同的生物样品之间的复制。鲁棒性?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Store at RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Store at 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Store at -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store at -20 °C
1 M Glycine			Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Prepare fresh
5 M NaCl			Store at RT
0.5 M EDTA			Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Store at RT
			Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
			Table of Equipment