الجمع بين المناعي وFISH DNA على الحفاظ على النواة 3D-الطور البيني لدراسة التغيرات في منظمة النووية 3D
Summary
نحن هنا وصف بروتوكول للكشف في وقت واحد من التعديلات من قبل هيستون تسلسل الحمض النووي عن طريق المناعي وFISH DNA تليها المجهري 3D والتحليلات (3D المناعية DNA FISH).
Abstract
الفلورسنت في الموقع التهجين باستخدام مجسات DNA على نواة-3 الأبعاد الحفاظ تليها المجهري متحد البؤر 3D (3D FISH DNA) يمثل الطريق الأكثر مباشرة لتصور موقع مواضع الجينات، الكروموسومات أو الأقاليم الفرعية في جميع الأراضي الخلايا الفردية. هذا النوع من التحليل يقدم نظرة ثاقبة في الهندسة المعمارية العالمية للنواة وكذلك سلوك مواضع الجينومية ومناطق محددة في غضون النووية. المناعي، من ناحية أخرى، يسمح الكشف عن البروتينات النووية (الهستونات تعديل، ومعدلات المتغيرات هيستون، آلات النسخ والعوامل، النووية شبه مقصورات، الخ). التحدي الرئيسي في الجمع بين المناعي و 3D FISH DNA هو، من ناحية الحفاظ على حاتمة الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة وكذلك الهندسة المعمارية 3D للنواة، وعلى الجانب الآخر، للسماح للتغلغل التحقيق للكشف عن الحمض النووي مواضع الجينات أو الكروموسومات الأراضي 1-5. هنا نقدم البروتوكول الذي يجمع بين التصور من التعديلات لونين مع مواضع الجيني في 3D النوى الحفاظ عليها.
Introduction
إنشاء آليات جينية الزناد وراثة الخلية والتنموية محات من نوع النسخي محددة. في مستوى واحد وهذا ينطوي على تعديل لونين من التعبئة والتغليف التي تحدد المناطق الجينية النشطة أو الصمت. على نطاق أوسع، وتنظيم 3D العالمية للجينوم النووية والهندسة المعمارية أيضا أن تلعب دورا في السيطرة على أنماط النسخي. وهكذا، تشريح هذه الميزات epigenomic أمر ضروري لفهم كامل لكيفية الجينات وينظم 6-11.
الجمع بين FISH DNA المناعي و 3D فرصة فريدة لاستكمال التحليلات الجزيئية والكيمياء الحيوية عن طريق تقييم التفاعلات محددة / جمعيات تسلسل الحمض النووي و / أو البروتينات داخل النواة. وعلاوة على ذلك، في حين الجينوم على نطاق تقنيات إنتاجية عالية مثل مناعي لونين (رقاقة يليها) أو الكروموسوم التشكل القبض على جانب التسلسل العميق (4C-يليها، 5C، مرحبا C) تقديم دات العالميةوعلى السكان الخلية 12، تقنيات FISH المناعي / DNA يمكن من إجراء تحليلات على مستوى خلية واحدة.
نحن هنا وصف بروتوكول للكشف في وقت واحد من التعديلات من قبل هيستون تسلسل الحمض النووي عن طريق المناعي وFISH DNA تليها المجهري 3D والتحليلات (3D المناعية FISH). وميزة هذا البروتوكول هو التصور المشترك لDNA والحفاظ على هياكل البروتين. وقد مكن خبرتنا في هذا المجال لنا لتحسين وتبسيط البروتوكولات القائمة. على الرغم من أننا قد استخدمت هذا البروتوكول للكشف عن الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فواصل في الخلايا الليمفاوية التي تمر إعادة التركيب، يمكن تطبيق هذه الطريقة لغيرها من البروتينات وغيرها من أنواع الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام تقنيات المفصلة أعلاه في المختبر لتحليل تنظيم إعادة التركيب V J (D) من الغلوبولين المناعي ومواضع Tcra / د في تطوير الخلايا الليمفاوية 30،31. ونحن واثقون من أن يمكن تكييفها هذه التقنية للكشف عن البروتينات النووية المختلفة، مقصورات النووية ومواضع، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء المختبر Skok، وخاصة سوزانا هيويت، لإجراء مناقشات وتعليقات. ويدعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح R01GM086852، RC1CA145746 (JAS). JAS هو سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية عالم المجتمع. JC هو زميل معهد [إيرفينغتون] من معهد أبحاث السرطان. ويدعم MM من قبل الوطنية للعلوم منحة التعليم مؤسسة دراسات عليا التكاملية والبحوث التدريبية (NSF IGERT 0333389).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. |
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories–a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus – charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3′ Igk enhancer induces ‘decontraction’ of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus ‘decontraction’ and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
