Summary
Ein Modell der Quetschung schweren Verletzungen des Rückenmarks beschrieben. Detaillierte präoperative, operative und postoperative Schritte beschrieben, um ein konsistentes Modell zu erhalten.
Abstract
Die translationale Potenzial neuartiger Behandlungen sollten bei schweren Verletzungen des Rückenmarks (SCI) Prellung Modelle untersucht werden. Eine detaillierte Methodik wird beschrieben, um ein konsistentes Modell der schweren SCI erhalten. Verwendung eines stereotaktischen Rahmen und computergesteuerte Impaktor ermöglicht die Erzeugung von reproduzierbaren Verletzungen. Hypothermie und Harnwegsinfektion erhebliche Herausforderungen in der postoperativen Phase. Eine sorgfältige Überwachung der Tiere mit tägliche Aufnahme und Blase Ausdruck ermöglicht die frühzeitige Erkennung von postoperativen Komplikationen. Die funktionellen Ergebnisse dieser Prellung Modell entsprechen Durchtrennung Modelle. Die Quetschung Modell kann verwendet werden, um die Wirksamkeit der beiden neuroprotektive und neuroregenerative Ansätze zu bewerten.
Introduction
Wahl des geeigneten Modells Verletzung ist entscheidend für die präklinische Evaluierung neuer Behandlungen für Rückenmarksverletzungen (SCI). 1,2,13 In einer aktuellen Umfrage von Ärzten und Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Neurotrauma Prellung Modell, um Hemisektion oder vollständige Durchtrennung Modelle Gegensatz wurde allgemein akzeptiert als klinisch relevant. 8 Diese Meinung auf der Beobachtung, dass die Mehrheit der Verletzungen des Rückenmarks beim Menschen in der Natur ist kontusive beruht. 10 Die Biologie der Prellung scheint auch anders zu sein Hemisektion oder Durchtrennung Modelle. Iseda 11, et al. verglichen die Wirkung von intraspinal Chondroitinase ABC Injektion auf Neuroregeneration separat in Hemisektion und Prellung Modelle. 4 axonale Regeneration wurde in der neuronalen Brücke in Hemisektion beobachtet, nicht aber die Prellung SCI Gruppe. Die Hemisektion oder vollständige Durchtrennung Modelle auch Bedingungen schaffen, bekannt zu existieren nur in einer sehr kleinen Teil der clinical Umständen. Zum Beispiel haben mehrere Forscher Gerüst-basierte Interventionen zur Implantation verwendet in der Läsion Hohlraum nach Hemisektion oder vollständige Durchtrennung der Regeneration zu fördern. 6 Dieser Ansatz wird klinisch irrelevant, weil Schaffung eines Hohlraums innerhalb verletzte Rückenmark ist unpraktisch und wahrscheinlich unethisch.
Variabilität in der funktionellen Erholung bleibt eine große Herausforderung für die Prellung Modelle. 5,12 Diese Variabilität kann durch den Einsatz von Computer-gesteuerten Impaktor und Stabilisierung der Wirbelsäule vor dem Aufprall für eine gleichmäßige Antrieb über das Rückenmark Volumen vor allem die ventral motorischen Bahnen minimiert werden . Anzumerken ist, dass Plastizität und Sicherheiten Beitrag von überlebenden Axone der vorherrschende Mechanismus der Regeneration nach Verletzungen des Rückenmarks ist werden. 1 Daher auch geringfügige Änderungen in Technik Prellung kann deutlich unterschiedlichen Ergebnissen führen. Zu diesem Zweck haben wir entwickeltein Modell der schweren Verletzungen des Rückenmarks, die im Einklang Kontusionsvolumen und funktionelle Erholung vergleichbar mit Durchtrennung Modelle ergibt. Dieses Modell kann für die Untersuchung sowohl die Neuroprotektion und Neuroregeneration Strategien als Proof of Concept für die Wirksamkeit der Behandlung eingesetzt werden.
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Protocol
1. Vorbereitung Bevor Spinal Cord Injury
Die chirurgischen Instrumente für diese Prozedur erforderlich sind Skalpell, Pickups mit und ohne Zähne, hemostats, selbsthaltend Gurtstraffer, feine Spitze rongeurs, Nadel-Treiber, resorbierbaren Fäden, und die Haut Clip-Applikatoren. Andere chirurgische Versorgung erforderlich sind OP-Abdeckungen, steril Blätter für OP-Feld, Gaze Schwämme, Baumwolle-Applikatoren, und Metallfolie. Autoklaven werden die chirurgischen Instrumente und Zubehör vor der Operation. Verwenden Sie die einzelnen Satz von Instrumenten und Zubehör für ein Tier. Reinigen Sie den OP-Bereich und eine Vorrichtung (Impaktor, Lichtquelle, stereotaktischen Rahmen, Glasperlen Sterilisatoren und Heizkissen) mit Alkoholtupfer.
Öffnen Sie die OP-Abdeckungen und sterile Handschuhe, um das Operationsfeld sorgfältig Vermeidung von Kontaminationen drapieren. Öffnen Sie die einzelnen Instrumente steril und sorgfältig platzieren diejenigen in das OP-Feld. Decken Sie die Knöpfe und Griffe von the Gerät wahrscheinlich während des Verfahrens mit der sterilen Metallfolie benötigt. Schalten Sie die Glasperle Sterilisator, bereit zu sein für den Einsatz während des Verfahrens.
2. Vorbereitung der Tiere
Bringt die Ratten im Labor-Bereich einige Stunden vor dem eigentlichen Verfahren. Verwalten Schmerzmittel mindestens eine Stunde vor dem erwarteten Verfahren (typischerweise buprinorphine 1,5 ml von 0,006 mg / ml subkutan). Verwalten präoperative Antibiotika (in der Regel Baytril 4 mg / kg subkutan). Anesthetize die Ratten mit 90 mg / kg Ketamin und warten, bis es keine Zehen Prise Antwort. Ertasten Sie den prominentesten Dornfortsatz in der Brustwirbelsäule. Dieses Niveau entspricht typischerweise mit T10 Dornfortsatz. Markieren Sie den Ort der geplanten Ebene in Bezug auf T10. In unserem Labor führen wir eine T10 Verletzungen. Die folgende Erzählung beschreibt die Technik des T10 SCI. Shave a 3 cm x 6 cm Rechteck längs und zentriert bei T10 Ebene. Reinigen Sie die Haut dreimal with Betadine Lösung. Apply Augen Schmiermittel auf jedes Auge. Übertragen Sie die Ratte in einer komfortablen Position, um das Operationsfeld sorgfältig Vermeidung von Kontaminationen. Legen Sie eine rektale Temperatursonde, um die Kerntemperatur überwachen und passen Sie die Heizung entsprechend zu Tier Temperatur so normal (~ 37,5 ° C) zu halten. Decken Sie die Ratte mit einem Operationstuch mit einem Fenster über dem OP-Gebiet.
3. Chirurgische Vorgehensweise
Beginnen Sie mit einem ca. 4 cm langer Schnitt mit einem # 10 Klinge auf dem T10 Marke zentriert. Fahren Sie geduldig sezieren Faszie und Muskel Schichten weg von den T9-T11 Dornfortsätze und Plättchen. Zeigen Wundhaken, um Muskeln und Faszien Einfahren vom Knochen. Während die Stabilisierung der Dornfortsatz T9 scharf unterteilen die interspinalen Lig. zwischen T9 und T10 mit einer feinen Schere. Ebenso stabilisieren die T10 Dornfortsatz und teilen die interspinalen Band zwischen T10-T11. Verwenden Schleife Vergrößerung complete die Aufteilung der Bänder den ganzen Weg durch das Lig. flavum (Abbildung 1). Die Thekalsack ist leicht ersichtlich, wenn das Ligamentum flavum wird getrennt. Mit feiner Spitze rongeurs sorgfältig ausführen stückweise Laminektomie bilateral bei T10. Äußerste Sorgfalt wird angewendet, um einen Abwärtsdruck auf den Thekalsack und unbeabsichtigte Verletzungen von den rongeur Tipps vermeiden. Die Lamina und Dornfortsatz T10 vollständig entfernt wird.
Bewegen Sie das Tier in Position auf Stabilisierung Plattform. Verwenden Stabilisierung Klemmen, um die Wirbelsäule durch Spannen der lateralen Seite des T11 Wirbelkörper durch die seitlichen Partien der T9 Wirbelkörper gefolgt immobilisieren. Achten Sie darauf, um die Ratte in die Plattform zu komprimieren mit den stabilisierenden Schellen wie dieser Raum für Atembewegungen einschränken würde und fügen unerwünschten Stress das Tier. Nach der Sicherung der Wirbelsäule Einstellungen auf dem Computer-gesteuerten Impaktor überprüft. Wir verwenden in der Regel Impaktor Spitze von 3,0 mm bei einer spEED von 4 cm / s mit einer Tiefe von 2 mm und einer Verweilzeit von 0,3 sec. Verlängern Sie die Impaktor Spitze und absenken, bis es berührt nur die Oberfläche Schnur. Fahren Sie die Spitze und senken das Gerät 2 mm in Richtung der Oberfläche des Rückenmarks. Lassen Kolben bei 4 cm / sec bis schwere Prellung des Rückenmarks Verletzungen verursachen. Erreiche Blutstillung mit gerade genug Druck, um die Baumwolle-Spitze-Applikator in Position zu halten, wobei Sie darauf achten, keinen unnötigen Druck auf das Kabel zu schaffen. Naht Muskeln und Faszien Schichten mit einer Figur-8 Stich man aufpassen, nicht zu eng ziehen Sie die Verwendung von resorbierbaren Fäden. Schließen Sie die Haut mit einem Minimum von 2 kleinen Heftklammern, bis zu 4 oder 5 Klammern verwendet werden, wenn Teile der Einschnitt nach den ersten 2 oder 3 Klammern offen bleiben werden.
3. Post-Prozedur Pflege
Platz Ratten in einer warmen Umgebung von etwa 33-35 ° C für 24 Stunden nach der Operation. Dies bringt einen Inkubator (während sie bewusstlos sind) und einen beheizten Raum Käfig, sobald sie sich zu bewegen beginnen. Sobald Ratten sind voll awake, verwalten 5 ml Kochsalzlösung, 1,5 ml (0,006 mg / ml) von buprinorphine und 0,1 ml Baytril subkutan alle. Fahren Sie mit buprinorphine subkutan zweimal täglich für ersten 24-48 h und Baytril einmal täglich für 7 Tage. Blasen sollte manuell ausgedrückt werden dreimal täglich bis zur Rückkehr der Blasenfunktion (<2 ml Urin in den frühen Morgenstunden Ausdruck an 3 aufeinanderfolgenden Tagen). Auch Tiere sollten während dieser Zeit für eine Infektion (Blut im Urin, weißliche Farbe, oder üblen Geruch) überprüft werden, verminderte körperliche Aktivität oder Probleme mit der Wundheilung. Zur Feststellung der Infektion sollten mit einer erhöhten Dosierung (oder Re-Initiation) von Antibiotika in Abstimmung mit den örtlichen Tierärzten begegnet werden. Wiegen Ratten täglich beginnend am Tag nach der Operation, um ihre Genesung zu beurteilen.
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Representative Results
Läsionsvolumen
Wir haben große und konsequente Läsion Volumina nach der oben beschriebenen Technik erhalten. Mit einem blauen Färbung Luxol schnell eine mittlere Läsion Volumen von 2,04 mm 3 (95% CI 1,9 bis 2,18) (n = 5 Tiere) erhalten wurde. Abbildung 2 zeigt die mittlere Läsionsvolumen mit einem Vertreter Färbung mit Luxol schnell blau durch die Läsion Epizentrum.
Functional Scores
Die Verhaltens-Noten wie von der Basso, Beattie, Bresnahan (BBB)-Skala gemessen werden in Abbildung 3 dargestellt. Nach 12 Wochen wurden die Ratten in der Kontrollgruppe erreicht eine mittlere BBB Punktzahl von 2,2 ± 1,1 (n = 10 Tiere).
Andere Parameter
Basierend auf unseren jüngsten Erfahrungen mit 32 Tier-Operationen die Überlebensrate dieser Technik ist 93,4%. Alle Todesfälle wurden persistent Harnwegsinfektion (HWI) durch Tieropfer gefolgt zu vermeiden Zusammenhang übermäßige Schmerzen und Leiden. Nach Abschluss des Kurses von Antibiotika für 7 Tage 16,7% Tiere entwickelten UTI. Die mittlere Zahl der Tage für den Nachweis von UTI postoperativen betrug 14,6 ± 7,6 Tage. Interessanterweise sind die Tiere Kontrolle über die Blasenfunktion im Durchschnitt 13 Tage nach der Verletzung (Mittelwert 13,33 ± 3,6 Tage) erreicht. Ratten, die UTI entwickelt brauchte länger, um Kontrolle über die Blasenfunktion zu erreichen, wie den Ratten ohne UTI (Kontrolle über die Blase bei Ratten mit UTI - 16 ± 1 Tage gegenüber 12,8 ± 3,7 Tage Kontrolle über die Blasenfunktion bei Ratten ohne UTI, p = 0,03) verglichen. In der Kohorte, die Kontrolle über die Blase erreicht innerhalb von 14 Tagen keine nachträgliche UTI erkannt wurde. Wie in Abbildung 4 dargestellt, gab es eine anfängliche Gewichtszunahme nach SCI wahrscheinlich von Wasseransammlungen. Das Gewicht sank anschließend stabilisiert und auf ein niedrigeres Niveau (ca. 10-12% niedriger als Ausgangswert) in etwa 10 Tage.
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Abbildung 1. Vertebral Anatomie der Ratte aus dem hinteren Ansatz (links) zeigt, die Dornfortsätze und Plättchen. Die Position des Ligamentum flavum (LF) in dem Raum zwischen den Lamellen dargestellt. Mid-Saggital Abschnitt (rechts) zeigt die relative Position des Lig. flavum und der interspinalen Band in Bezug auf das Rückenmark.
Abbildung 2. Bar Graph Läsionsvolumen (in mm 3, Y-Achse) in Tieren, die schweren Verletzungen des Rückenmarks (links). Ein Vertreter Längsschnitt durch Verletzungen Epizentrum nach Luxol schnelle Blau-Färbung (rechts).
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Abbildung 3. Mittlere BBB (Y-Achse) Punktzahl der Ratten im Laufe von 3 Monats-Follow-up (X-Achse) zeigt minimale Erholung typisch für schwere SCI.
Abbildung 4. Linie Diagramm, Variation in der täglichen Gewicht (in g, Y-Achse) von Ratten über 2 Wochen Dauer (X-Achse) nach der Induktion von Rückenmarksverletzungen.
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Discussion
Mehrere neuartige Behandlungen wurden kürzlich frühen Versprechen im Bereich der SCI die Forschung gezeigt. 3 sorgfältige Auswertung dieser Behandlungen ist in klinisch relevanten Modell SCI wichtig, Strategien mit maximaler translationalen Potenzial auszuwählen. Ein Schema der Einstufung wurde vor kurzem entwickelt, um die Stärke der präklinischen Studien zu evaluieren. 9 Diese Regelung betont die Bedeutung der Verwendung von schweren Prellung Modell SCI. Hier beschreiben wir ein solches Modell der schweren Prellung SCI mit konsistenten Läsion Volumen und funktionell Partituren ähnlich denen der Durchtrennung Modelle. Dieses Modell kann als "proof of concept", um die Wirksamkeit der Behandlung sowohl für Neuroprotektion und Neuroregeneration Strategien zu etablieren genutzt werden.
Die Erzeugung einheitlicher kontusive SCI bleibt herausfordernd. Für die Reproduzierbarkeit ist es wesentlich, dass die Schädigung möglichst gleichmäßig erfolgen. Die gezielte Ebene des Rückenmarks muss konsequent fr identifiziert werdenom Tier zu Tier. Die Entfernung der Knochen während Laminektomie sollte sorgfältig durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass keine Knochensplitter in den Wirbelkanal verbleiben, diese konnten Kompression Verletzungen verursachen und stellen unerwünschte Schwankungen in der Nachspielzeit Mechanismen und Erholung Potenzial. Wir haben mehrere Schritte, um die Einheitlichkeit einschließlich Größe der Impaktor, starren Stabilisierung der Wirbelsäule auf einem Rahmen montiert mit stabilisierenden Arme sicherzustellen angenommen, mit einem einheitlichen Aufprallgeschwindigkeit und Tiefe Impaktion. Es ist wichtig, dass die Ratte bequem positioniert werden, wenn die stabilisierenden Zange an den Wirbelkörpern eingespannt sind. Etwaige Abweichungen in der Ausrichtung der Wirbelsäule oder übermäßige Belastung während der Klemmung kann verändern die Biomechanik des Aufpralls. Wir verwendeten einen 2,5 mm Impaktor da die durchschnittliche Größe der Ratte Rückenmark in unserer Region von Interesse ist 2,5-3 mm. Die Kontaktzeit oder Verweilzeit wurde einheitlich bei 0,3 sec in unseren Experimenten eingestellt. Doch in unserer Beobachtung und Berichte aus anderen Labors, für eine schwere Modell der SCI die Tiefe der Auswirkungen ist der wichtigsteParameter. Bei den in diesem Dokument beschriebenen Auswirkungen bei einer konstanten Tiefe von 2 mm geliefert. Andere Faktoren, die Einheitlichkeit gehören Personal Training, übersichtliche Visualisierung des Gewebes und Impaktor Spitze zum direkten Auswirkungen in der Nabelschnurgewebe (und nicht die knöchernen Strukturen) zu gewährleisten.
Die Ratten sollten ständig während des Verfahrens für notwendig Vitalfunktionen vor allem Kerntemperatur und die Atmung beobachtet werden. Hypothermie ist die führende Ursache von Sterblichkeit während und unmittelbar nach der Narkose Verwaltung. Überwachung von Kerntemperatur mit Rektalsonde und angemessen Heizkissen wird diese Komplikation zu vermeiden. Falls die Atmung wird unregelmäßig oder das Tier aufhört zu atmen, sollte der Vorgang sofort bis auf den Ausgangswert zurück Atmung gestoppt werden. Übermäßige Schmerzen und oder versehentliche Überdosierung von Schmerz und Betäubung Medikament kann auch in Atemproblemen führen. Die Ratten sollten sorgfältig überwacht werden post-Verfahren. Ihr wAchten sollte genau gemessen werden und ein Verlust von> 20% vom Ausgangswert Gewicht sollte eine Untersuchung in Futter-und Wasseraufnahme, Harnwegsinfektionen, Hautschäden, post-SCI Ileus usw. Frühe Beratung mit Tierärzten für die Bewertung und Behandlung veranlassen ist entscheidend in solchen Situationen. Wie bereits erwähnt, sollte Ratten, die keine Kontrolle über die Blase wurden von Tag 14 wieder zurück auf Antibiotika gestartet werden, um einen potenziell tödlichen Infektion der Harnwege zu vermeiden.
Verletzungen des Rückenmarks können entweder durch eine Verschiebung Verfahren oder Verfahren mit konstanter Kraft induziert werden. 5,12 Die Technik in diesem Papier beschriebene Verschiebung Verfahren, bei dem Kraft, feste Tiefe im Gewebe des Rückenmarks abgegeben wird. Die Verwendung eines computergesteuerten Impaktor ermöglicht eine Stufe der Kontrolle, die nicht erreichbar ist von den anderen üblichen Methoden der experimentellen SCI. Der Clip Kompressions-Technik nicht für eine stumpfe, kontusive Kraft mit sofortiger Freisetzung zu ermöglichen, während die NYU Auswirkungenoder abhängig von der Schwerkraft um die Kraft der Quetschung zu bestimmen. Diese Techniken zwar reproduzierbar, nicht erlauben die Simulation von Bedingungen in einem Kfz-Unfall, die häufigste Ursache von akuten SCI beim Menschen aufgetreten. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Schwere der Verletzungen, direkt mit Tiefenwirkung als die Geschwindigkeit der Wirkung korreliert. 7 Daher ist dieses Modell ermöglicht eine schwere SCI routinemäßig mit dem Potential durchgeführt werden, um die Schwere durch einen größeren Bereich von Kombinationen von Kraft und Verdrängung zu ändern .
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Disclosures
Offenlegung der Finanzen keine
Funding Offenlegung keine.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. N. Banik und Dr. D. Mitchell für ihre Führung in der Entwicklung dieses Modells.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
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